Transgenuttryck i odlade celler med hjälp av orenade rekombinanta adenoassocierade virusvektorer

Rekombinanta adenoassocierade virala vektorer (rAAV) kan uppnå potent och hållbart transgenuttryck utan integration i ett brett spektrum av vävnadstyper, vilket gör dem till ett populärt val för genleverans i djurmodeller och i kliniska miljöer. Förutom terapeutiska tillämpningar är rAAVs ett användbart laboratorieverktyg för att leverera transgener skräddarsydda för forskarens experimentella behov och vetenskapliga mål i odlade celler. Några exempel är exogena reportergener, överuttryckskassetter, RNA-interferens och CRISPR-baserade verktyg, inklusive de för genomomfattande skärmar. rAAV-transduktioner är mindre skadliga för cellerna än elektroporering eller kemisk transfektion och kräver ingen speciell utrustning eller dyra reagenser för att produceras. Rålysat eller konditionerade medier som innehåller rAAVs kan tillsättas direkt till odlade celler utan ytterligare rening för att transducera många celltyper - en underskattad egenskap hos rAAVs. Här tillhandahåller vi protokoll för grundläggande transgen kassettkloning och demonstrerar hur man producerar och applicerar råa rAAV-preparat på odlade celler. Som bevis på principen visar vi transduktion av tre celltyper som ännu inte har rapporterats i rAAV-applikationer: placentaceller, myoblaster och tunntarmsorganoider. Vi diskuterar lämpliga användningsområden för råa rAAV-preparat, begränsningarna för rAAVs för genleverans och överväganden för kapsidval. Detta protokoll beskriver en enkel, billig och effektiv metod för forskare att uppnå produktiv DNA-leverans i cellkultur med hjälp av rAAV utan behov av mödosam titrering och reningssteg.