Robert Tjian ve Xavier Darzacq'a destekleri ve laboratuvar ekipmanlarını kullandıkları için teşekkür ederiz. KP1 ve LK03 rep/cap plazmidleri hediyesi için Mark Kay'e ve AAV4 rep/cap plazmidi için Luk Vandenberghe'ye teşekkür ederiz. Finansman, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (34430, RT) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü Eğitim Programı EDUC4-12790 tarafından sağlandı. N.W., Berkeley Kök Hücre Merkezi'nden Siebel doktora sonrası bursu ve Alman Araştırma Vakfı'ndan (DFG) Walter Benjamin bursu aracılığıyla fon aldığını kabul ediyor.

Hücre Kültürlerinde Ham Vektör Üretimi ve Etkin DNA Dağıtımı

A.C.M., Janssen Pharmaceuticals'ın danışmanıdır ve NewBiologix için SAB'de hizmet vermektedir. Diğer tüm yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Klonlama Klonlama protokolü, yukarıda kullanılan pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 plazmidi ile sınırlı değildir ve bir araştırmacının deneysel ihtiyaçlarına göre kolayca değiştirilebilir. ITR içeren birçok plazmit, satın alınmak üzere çevrimiçi olarak kolayca temin edilebilir. Örneğin, hem Cas9 hem de bir sgRNA klonlama bölgesi içeren plazmitler mevcuttur, ancak oligonükleotid tavlama ve PNK tedavisi30 gibi birkaç ek adım gerektirir. Ek olarak, yalnızca ITR'leri olan ve hiçbir iç düzenleyici elemanı olmayan bir çoklu klonlama bölgesi (MCS) içeren plazmitler bulunabilir31. Farklı plazmitler kullanılacaksa, sindirim için kullanılan kısıtlama enzimleri (RE) tipik olarak bu protokolde değiştirilmesi gerekebilecek tek elementlerdir. Bununla birlikte, rAAV'nin bir sınırlaması, sınırlı kargo kapasitesidir. Kapsidin fiziksel sınırlamaları nedeniyle, vektör genomu ITR'ler dahil 4.9 kb'yi geçmemelidir.
Plazmidi bakterilerden izole ederken, üçlü plazmit transfeksiyonu veya transdüksiyonu sırasında hücrelere verilen zararı azaltmak için endotoksin düşük veya içermeyen bir midiprep veya maxiprep kiti kullanmak çok önemlidir. Miniprep kitlerinden elde edilen plazmid genellikle daha yüksek safsızlıklar, azaltılmış konsantrasyonlar ve daha az süper sarmal DNA içerir ve bunların tümü rAAV'nin aşağı akış üretimini etkileyebilir ve bu nedenle önerilmez.
Klonlama sırasında ITR'lerin yapısını ve özelliklerini anlamak çok önemlidir. İlk olarak, PCR'yi ITR aracılığıyla kullanmak son derece zordur. ITR'ler aracılığıyla PCR amplifikasyonu gerektiren klonlama tasarımlarından kaçınılmalı ve ayrıca Gibson montaj klonlama tekniğinin kullanımı sınırlandırılmalıdır. Bu nedenle, restriksiyon enzimi klonlaması, ITR içeren plazmitlere klonlama için tercih edilen yöntemdir. Ayrıca, dizilenen bölge ITR'yi içeriyorsa, Sanger dizilemesi için belirli primerler uyumlu olmayabilir. Bunun yerine, daha kesin dizileme sonuçları elde etmek için ITR'lerden uzağa ve vektör genom gövdesine dizilenen primerlerin kullanılması önerilir. İkincisi, ITR'ler plazmit amplifikasyonu için bakterilere dönüştürüldüğünde delesyonlara, yeniden düzenlemelere ve mutasyonlara eğilimlidir32,33. Bu olayları hafifletmek için, Stbl3 gibi rekombinasyon eksikliği olan yetkin bakteri suşlarının kullanılması ve hücresel bölünmeleri yavaşlatmak için 30 °C'de inkübe edilmesi önerilir. Son olarak, ITR'leri olmayanlar bir büyüme avantajı sağlayabileceğinden ve daha büyük olabileceğinden, daha küçük kolonilerin yeniden düzenleme veya silme olmaksızın klonlara karşılık gelebileceği gözlemlenmiştir. Bu nedenle, küçük kolonilerin seçilmesi önerilir.
Vektör üretimi rAAV vektörünün başarılı üretimi birden fazla unsurdan etkilenebilir. Kritik bir faktör, transfeksiyon için kullanılan HEK293 veya 293T hücrelerinin sağlığıdır. Genel olarak, düşük pasaj sayıları idealdir, çünkü yüksek pasajlı hücreler rAAV titrelerini azaltabilen genotipik ve fenotipik varyanslar sergileyebilir. Ek olarak, etkili üretim için tohumlanan hücrelerin yoğunluğu %75-90 oranında olmalıdır. Seyrek hücreler düşük vektör verimi üretir, çünkü vektör üretmek için daha az hücre bulunurken, aşırı büyümüş hücreler verimli bir şekilde transfekte edilmeyecektir.
Reaktif lotları, hücre stokları ve genel laboratuvardan laboratuvara değişkenlik arasındaki farklılıklar, transfeksiyon verimlilikleri ve üretim titresindeki farklılıklara katkıda bulunur. Titre iyileştirmelerine yol açabilecek optimize edilebilir bir faktör, transfeksiyon reaksiyonlarındaki plazmid:PEI oranıdır. Taze (<1 aylık) PEI MAX kullanmak çok önemlidir. Başlangıç noktası olarak 1:1'lik bir plazmid:PEI oranının kullanılması ve transfeksiyon veya transdüksiyon verimliliği zayıf görünüyorsa, birkaç farklı oranı test etmeniz önerilir. Burada klonlama için başlangıç materyali olarak kullanılan CMV.Luc.IRES.EGFP raportör trangene gibi görsel bir okumaya sahip bir transgen kullanılıyorsa, titre optimizasyonu en kolay yoldur. Optimizasyonu gerçekleştirmek için, 12 oyuklu bir plaka kullanarak ve plazmit kütlelerini ve reaktif hacimlerini ikiye küçültün (nihai plazmit kütlesi 2,6 μg'dir) protokol adımı 3'ü izleyin. PEI hacmini, 0,25'lik artışlarla 1:0,75 ila 1:3 arasında değişen oranlara karşılık gelecek şekilde ayarlayın (Şekil 6). Her reaksiyonu 15 dakika sonra 950 μL SF ortamı ile seyreltin. Kolaylık sağlamak için, üçlü plazmitleri içeren bir ana karışım yapılabilir ve PEI eklenmeden önce 1,5 mL'lik tüplere ayrı ayrı pipetlenebilir - Ek Dosya 2'ye bakın. Vektörü hasat edin, ilgilenilen hücreleri ve görüntüyü dönüştürün. En yüksek transdüksiyon verimliliğine (GFP + hücrelerinin oranı) sahip kuyu, PEI: DNA'nın en yüksek titresine ve en optimal oranına karşılık gelir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg"> Şekil 6: PEI optimizasyon iş akışı. PEI optimizasyonu için gerekli adımların şeması. Çoklu plazmit oranları: Optimal oranı belirlemek için PEI test edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hasat ve titre hususları rAAV vektörünü hasat etmek için kullanılan donma/çözülme tekniği, HEK293 hücrelerini, kültürlenmiş hücreleri dönüştürmek için arıtılmış lizatın doğrudan kullanımıyla uyumlu bir şekilde etkili bir şekilde parçalar. AAV1, AAV8 ve AAV9 gibi belirli rAAV serotipleri, vektör üretimi sırasında hücrelerden salınır ve donma/çözülme döngüleri34 olmadan kültürlenmiş hücre ortamından hasat edilebilir. Burada açıklanan yöntem tipik olarak AAV2 kapsidleri kullanılırken 1 x 10 10 VG/mL ve AAV8 için 1 x10 11 VG/mL mertebesinde titreler verir. Deterjan veya diğer kimyasal bazlı lizis ile daha yüksek titreler elde edilebilirken, bunlar aşağı akış kullanımında hücreler için zararlıdır ve rAAV'lerin lizattan daha fazla saflaştırılmasını gerektirir. Düşük titre, bir araştırmacının ham preparatların araştırma ihtiyaçları için uygun olup olmadığını belirlerken göz önünde bulundurması gereken bir ödünleşimdir, ancak burada açıklanan yöntemlerle üretilen marjinal olarak daha düşük titreler birçok hücre tipini çok iyi bir şekilde dönüştürebilir (temsili sonuçlara bakınız). Transfeksiyon verimliliği ve hücre sağlığına ek olarak, vektör titreleri, rAAV üretimi sırasında kullanılan kapsid ve VG35 içindeki transgenin boyutuna ve dizisine bağlı olarak değişir.
Ham vektör preparatları hasat edilirken, üçlü plazmit transfeksiyonu sırasında kullanılan plazmit DNA mevcut olabilir ve nadir olmasına rağmen, transdüksiyon sırasında aşağı akış transfeksiyonuna neden olabilir. Ayrıca, paketlenmemiş VG'ler kapsidlerin dışına bağlanabilir ve çıplak ve yabancı tek sarmallı DNA'ya doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir36,37. Bu nedenle, hassas hücre tipleri, paketlenmemiş VG'leri ve plazmidi uzaklaştırmak için vektör preparatlarının DNaz sindirilmesini ve saflaştırılmasını gerektirebilir.
Ham bir preparatın titresi hesaplanmak istenirse, DNaz-dirençli partiküller (DRP) içindeki paketlenmiş VG sayısını ölçmek için qPCR gerçekleştirilebilir. Kısaca, az miktarda ham preparat, plazmit DNA'yı, kontamine nükleik asitleri veya kısmen paketlenmiş VG'yi uzaklaştırmak için DNaz ile sindirilir. Numune daha sonra qPCR'ye tabi tutulur ve DRP'lerin içindeki korumalı VG ölçülür, bu da ham preparatın mL başına vektör genomu birimlerine sahip bir titreile sonuçlanır 38. Kapsid titrelerini ölçen ELISA tabanlı tahliller kullanılarak vektör titrasyonu yapılması önerilmez. Vahşi tip AAV virüsü ile karşılaştırıldığında, rAAV, boş ve kısmen paketlenmiş kapsidlerin bir kısmından muzdariptir39. ELISA, genom içeriklerine bakılmaksızın tüm kapsidleri ölçecek ve paketlenmiş bir VG gerektiren bir preparatta bulunan transdüksiyon birimlerini abartacaktır.
Transdüksiyonla ilgili dikkat edilmesi gerekenler rAAV transdüksiyonlarını birçok faktör etkiler ve herhangi bir yeni deney için uygun değerlendirmeler yapılmalıdır. Transgen ekspresyonunu yönlendiren promotöre bağlı olarak, ekspresyon başlangıcı transdüksiyondan 4 saat sonra (hpt) kadar erken bir zamanda ortaya çıkabilir ve pik ekspresyon tipik olarak 48 hpt ile elde edilir. Hücrelerin ilk tohumlanmasından deneysel son noktaya kadar geçen süreyi akılda tutmak önemlidir. Bu, hücrelerin başlangıçtaki birleşmesini tahmin etmek ve deneyin sonunda aşırı büyümemelerini sağlamak içindir. Hücreler aşırı birleşirse, bir stres tepkisi nedeniyle hücresel davranış değişebilir ve deneysel sonuçları karıştırabilir. U2-OS gibi bazı hücre tipleri, aşırı büyümeyi / temas inhibisyonunu oldukça iyi tolere edebilir. Ek olarak, bu üretim protokolünün ürünü olan serumsuz şartlandırılmış ortamda uzun sürelere (48 saat +) dayanabilirler. Bununla birlikte, hassas hücre tipleri, transdüksiyon sırasında sağlığı korumak için serum ilavesini veya ham preparatın özel büyüme ortamı ile seyreltilmesini gerektirebilir. Serum içeren ortamın kullanılmasından kaynaklanan biraz azaltılmış transdüksiyon verimliliği, hücre sağlığı için potansiyel bir değiş tokuştur ve araştırmacı tarafından dikkate alınmalıdır.
Tipik olarak, hızla bölünen hücreler için, 48 hpt sonlandırılacak uygulamalar için yaklaşık% 50'lik bir başlangıç birleşimi en uygunudur. Bununla birlikte, izdiham, deneyin ihtiyaçlarına göre buna göre ayarlanabilir. Transdüksiyon verimliliğinin azalması nedeniyle tek katmanlı tip ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının %75'in üzerinde birleşme özelliğinin iletilmesi önerilmez. Kültürlenmiş hücre tiplerinin çoğu, ham rAAV preparatları ile gece boyunca inkübasyondan sonra başarılı bir şekilde transdüksiyon ve sağlıklıdır, ardından sabahları taze serum içeren besiyerine geçilir.
Kapsid serotipi, bir hedef hücreyi dönüştürmek için rAAV üretirken dikkate alınması gereken önemli bir faktördür, çünkü kapsid, hücresel tropizmin ve müteakip transgen ekspresyonunun birincil belirleyicisidir13. AAV2, birçok kültürlenmiş hücre tipini etkili bir şekilde dönüştürme kabiliyeti nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir serotiptir12. AAV2'nin bu özelliği, AAV2 için birincil bağlanma faktörü olarak hizmet eden heparin sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) ve bir tabaktaadaptasyondan büyümeye kadar kültürlenmiş hücreler üzerindeki yüksek HSPG seviyelerine atfedilebilir 40. AAV9 gibi diğer kapsidler, geniş hücre tiplerini dönüştürmede daha az etkilidir ve bu ayarda ifade edilmeyen güven bağlanma faktörleri ile açıklanabilir41. Bu nedenle, istenen bir hedef hücre literatürde daha önce rAAV ile test edilmemişse, kültürlenmiş hücrelerde ilk tercih edilen kapsid olarak AAV2'yi öneriyoruz.
Ham vektör preparatlarının önemli bir sınırlamasının, hayvan modellerinin dönüştürülmesi için uygun olmamaları olduğunu lütfen unutmayın. İn vivo çalışmalar, preparatların saflaştırılmasını ve kalite değerlendirmesinden geçmesini gerektirir.
Transgen ekspresyonu ve potansiyel entegrasyon hususları rAAV'ler, transgenin kalıcı ekspresyonuna güvenilir bir şekilde yol açmaz. Zamanla, VG'ler susturulabilir ve transgenik ekspresyon birkaç pasajdan sonra kapatılabilir42. Ek olarak, VG'lerin çoğunluğu epizomal kalır ve rAAV'ler, vahşi tip viral lizojenik bir enfeksiyonda olduğu gibi konakçı genomuna sık sık entegrasyona aracılık edecek veya VG'lerin replikasyonunu teşvik edecek viral Rep proteinlerini içermez43. Sonuç olarak, transdüksiyon hücrelerindeki epizomlar, sonunda bölünmeler yoluyla yavru hücreler arasında seyreltilecektir.
Bazal seviye entegrasyon, teslim edilen tüm transgenik DNA materyali için bir olasılıktır. Bununla birlikte, ITR içeren VG'ler daha yüksek bir frekanstaentegrasyona eğilimlidir 44. Bu nedenle, küçük bir hücre alt kümesinde bir transgenin kalıcı ekspresyonu gözlemlenebilir. Kullanıcılar, özellikle Cas9 gibi DNA kesici enzimler vermek için rAAV kullanırken bu olasılığı göz önünde bulundurmalıdır, çünkü çift sarmallı kırılmalar daha da büyük bir entegrasyon sıklığı ve kalıcı ekspresyon45 ile sonuçlanabilir. Bu, rAAV'yi endojen etiketleme veya gen ilavesi için homolojiye yönelik onarım şablonları sunmak için iyi bir aday haline getirirken, Cas9 yerleştirme olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır19,46.

Hücresel fonksiyonların moleküler bazlarının aydınlatılması genellikle hücre kültüründe transgenik DNA'nın ekspresyonunu gerektirir. İfade edilebilmesi için, transgenlerin bir hücrenin seçici zarından geçmesi ve çekirdeğeulaşması gerekir 1,2. Bu nedenle, hücrenin fiziksel engellerini etkili bir şekilde atlama ve merkezi süreçlerini manipüle etme yeteneği, yeni biyolojik fenomenleri ortaya çıkarmak için transgenez uygulamak için bir gerekliliktir. Bir yaklaşım, virüslerin yabancı DNA'yı iletme ve ifade etme konusundaki içsel yeteneğinden yararlanır 3,4.
Adeno-ilişkili virüs (AAV) en küçük memeli virüslerinden biridir: 4.7 kilobaz (kb), tek sarmallı DNA genomu, 25 nm'lik 60 mer'lik bir ikosahedral kapsidin içinde paketlenmiş rep (replikaz için) ve cap (kapsid için) olmak üzere iki gen içerir. Rep/cap genleri, viral replikasyon, üretim ve paketleme için gerekli olan en az dokuz benzersiz proteini kodlayan birden fazla promotöre, okuma çerçevesine ve ekleme ürününe sahiptir 5,6. Ek olarak, genomun her iki ucu, transdüksiyon 7,8,9,10 sırasında DNA replikasyonu, genom paketleme ve aşağı akış işleme için gerekli olan ters terminal tekrarları (ITR'ler) adı verilen ikincil yapılar içerir. ITR'ler, genomun kapsid içine paketlenmesi için gerekli olan tek DNA elementleridir ve bu nedenle AAV, viral rep/cap genlerini bir araştırmacının seçtiği düzenleyici elementler ve/veya ilgilenilen genlerle değiştirerek transgen iletimi amacıyla klonlanabilir6. Ortaya çıkan rekombinant AAV (rAAV), tasarlanmış bir vektör genomu (VG) ile, klinikte insan gen terapisi için yaygın olarak kullanılmaktadır ve başarılar toplamıştır11. Vektörün yeterince takdir edilmeyen bir kullanımı laboratuvardadır; rAAV'ler, bir araştırmacının deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için kültürlenmiş hücrelerde transgen ekspresyonunu verimli bir şekilde sağlayabilir12.
rAAV üretmek için en yaygın yöntem, HEK293 veya 293T hücrelerine üçlü plazmit transfeksiyonudur (Şekil 1). Yaygın olarak cis plazmidi olarak adlandırılan ilk plazmit, ITR'ler (pAAV) ile çevrili istenen transgeni içerir. Uygulamaya bağlı olarak, güçlü destekleyiciler veya CRISPR tabanlı araçlar gibi ortak elementlere sahip cis plazmitleri satın alınabilir. İkincisi, trans halinde sağlanan vahşi tip AAV rep ve cap genlerini içeren pRep/Cap plazmididir - yani, daha sonra cis plazmidi ile etkileşime giren düzenleyici ve yapısal unsurları ifade eden ayrı, ITR içermeyen bir plazmid üzerinde - ve bu nedenle trans plazmid olarak adlandırılır. VG'yi fiziksel olarak çevrelemeye ek olarak, kapsid hücresel tropizmietkiler 12,13. Araştırmacılar, serotipe özgü kapak genini trans halinde sağlayarak, verilen hedef hücre için optimize edilmiş bir kapsid serotipi seçerek transdüksiyon verimliliğini kolayca en üst düzeye çıkarabilirler. Son olarak, bir Dependoparvovirus olarak AAV, pAdΔF614,15 gibi üçüncü bir plazmit üzerinde sağlanan adenoviral yardımcı genler tarafından elde edilen viral promotörlerinden rep/cap ekspresyonunu aktive etmek için bir yardımcı virüs gerektirir. 72 saatlik üçlü plazmit transfeksiyonundan sonra, vektör, tekrarlanan donma/çözülme döngüleri ile üretici hücrelerden kültür ortamına salınabilir. Tüm plaka içeriği daha sonra toplanır ve büyük hücresel kalıntılar santrifüjleme ile çıkarılır; Ortaya çıkan medya süpernatanı, aşağı akış transdüksiyonları için hazır ham bir rAAV preparatıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg"> Şekil 1: Ham rAAV vektör üretimine genel bakış. Ham rAAV üretimi ve iletimi 5 gün içinde gerçekleştirilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
rAAV, elektroporasyon veya kimyasal/lipid bazlı transfeksiyon gibi hücresel toksisite, düşük verimlilik ve pahalı reaktifler ve ekipmanlarla yaygın olarak ilişkilendirilen diğer transfeksiyon yöntemlerine kıyasla transgen iletimi için daha uygun olabilir16,17. rAAV bu engelleri aşar ve genellikle minimum toksisite ve minimum uygulama süresi ile güçlü transgen ekspresyonu sağlar. Daha da önemlisi, rAAV'nin üretilmesi ve hücre kültürüne uygulanması basittir ve nadiren vektörün kültür ortamından saflaştırılmasını gerektirir (Şekil 1). Ek olarak, rAAV, Lentiviral transgen iletiminin aksine, VG'sini konakçı genomuna entegre etmez ve böylece insersiyonel mutajenezriskini azaltır 18. Transgen iletimi için rAAV kullanmanın potansiyel faydalarına rağmen, sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Daha da önemlisi, ITR'ler de dahil olmak üzere transgenin boyutu, kapsidin fiziksel kısıtlamaları nedeniyle 4.9 kb'yi geçmemelidir, böylece bir araştırmacının büyük düzenleyici unsurları ve transgenleri etkili bir şekilde sunma yeteneğini sınırlar. Ayrıca, rAAV entegre olmayan bir virüs olduğundan, transdüksiyon, bölünen hücrelerde geçici transgen ekspresyonu ile sonuçlanır ve kararlı ekspresyon için pratik olmayabilir. Bununla birlikte, çift rAAV ile verilen Cas9 ve homolojiye yönelik onarım (HDR) şablonlarını kullanan yöntemler, bir araştırmacı isterse, belirli genomik lokuslara dizileri kararlı bir şekilde eklemek için kullanılabilir19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Snapgene DNA viewing sofrware</td>
			<td>Snapgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>105533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>104963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAd&#916;F6</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boekel Scientific Economy Digital Incubator</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>133000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium, powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>113002042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbencillin (Disodium)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26 Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6333000022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Provided with purchase of Phusion Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-100</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Provided with purchase of restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>Provided with purchase of T4 Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Microprocessor Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>149566B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1149Y01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZR Plasmid Miniprep - Classic</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xma1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sma1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Vortex Genie 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanyo Ultra Low Freezer</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>14656-15267-16219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Line IL 10 with transparent window</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>strain #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>organoid growth medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeWo cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa1-6</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>UC Berkeley BSD Cell Culture Facility</td>
			<td>HUH-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2C12</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSkMC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-950-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-23060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Differentiation Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-23061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;EVOS Digital Color Fluorescence Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-563-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 96-well</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>104964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>130878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/9n (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAnc80L65AAP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KP1 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LK03 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV4 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Cas9.sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlock (synthetic DNA fragement)</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgene expression in cultured cells using unpurified recombinant adeno-associated viral vectors

Rekombinant adeno ile ilişkili viral vektörler (rAAV), çok çeşitli doku tiplerine entegrasyon olmaksızın güçlü ve dayanıklı transgen ekspresyonu sağlayabilir, bu da onları hayvan modellerinde ve klinik ortamlarda gen iletimi için popüler bir seçim haline getirir. Terapötik uygulamalara ek olarak, rAAV'ler, kültürlenmiş hücrelerde araştırmacının deneysel ihtiyaçlarına ve bilimsel hedeflerine göre uyarlanmış transgenler sağlamak için yararlı bir laboratuvar aracıdır. Bazı örnekler arasında eksojen muhabir genleri, aşırı ekspresyon kasetleri, RNA girişimi ve genom çapında ekranlar için olanlar da dahil olmak üzere CRISPR tabanlı araçlar bulunur. rAAV transdüksiyonları, hücreler için elektroporasyon veya kimyasal transfeksiyondan daha az zararlıdır ve üretmek için herhangi bir özel ekipman veya pahalı reaktifler gerektirmez. rAAV'leri içeren ham lizatlar veya şartlandırılmış ortam, birçok hücre tipini dönüştürmek için daha fazla saflaştırma yapılmadan doğrudan kültürlenmiş hücrelere eklenebilir - rAAV'lerin yeterince takdir edilmeyen bir özelliği. Burada, temel transgen kaset klonlaması için protokoller sağlıyoruz ve ham rAAV preparatlarının kültürlenmiş hücrelere nasıl üretileceğini ve uygulanacağını gösteriyoruz. Prensip kanıtı olarak, rAAV uygulamalarında henüz bildirilmemiş üç hücre tipinin transdüksiyonunu gösteriyoruz: plasental hücreler, miyoblastlar ve ince bağırsak organoidleri. Ham rAAV preparatları için uygun kullanımları, gen iletimi için rAAV'lerin sınırlamalarını ve kapsid seçimine ilişkin hususları tartışıyoruz. Bu protokol, araştırmacıların zahmetli titrasyon ve saflaştırma adımlarına ihtiyaç duymadan rAAV kullanarak hücre kültüründe verimli DNA iletimi elde etmeleri için basit, düşük maliyetli ve etkili bir yöntemi özetlemektedir.

Elucidating the molecular bases of cellular functions often requires the expression of transgenic DNA in cell culture. To be expressed, transgenes must penetrate through a cell&#39;s selective membrane and reach the nucleus1,2. Therefore, the ability to effectively bypass the cell&#39;s physical barriers and manipulate its central processes is a necessity for applying transgenesis to uncover new biological phenomena. One approach capitalizes on the intrinsic ability of viruses to deliver and express foreign DNA3,4.
Adeno-associated virus (AAV) is one of the smallest mammalian viruses: its 4.7 kilobase (kb), single-stranded DNA genome contains two genes, rep (for replicase) and cap (for capsid), packaged inside of a 60-mer icosahedral capsid measuring 25 nm. The rep/cap genes have multiple promoters, reading frames, and splice products which encode at least nine unique proteins required for viral replication, production, and packaging5,6. Additionally, both ends of the genome contain secondary structures called inverted terminal repeats (ITRs) that are necessary for DNA replication, genome packaging, and downstream processing during transduction7,8,9,10. The ITRs are the only DNA elements that are required for the packaging of the genome into the capsid, and therefore AAV can be cloned for transgene delivery purposes by replacing the viral rep/cap genes with a researcher&#39;s choice of regulatory elements and/or genes of interest6. The resulting recombinant AAV (rAAV), with an engineered vector genome (VG), is widely used in the clinic for human gene therapy and has amassed successes11. An underappreciated use of the vector is in the laboratory; rAAVs can efficiently achieve transgene expression in cultured cells to fulfill a researcher&#39;s experimental needs12.
The most common method for producing rAAV is by triple-plasmid transfection into HEK293 or 293T cells (Figure 1). The first plasmid, commonly called the cis&#160;plasmid, contains the desired transgene flanked by ITRs (pAAV). Depending on the application, cis plasmids with common elements, such as strong promoters or CRISPR-based tools, are available for purchase. The second is the pRep/Cap plasmid that contains the wild-type AAV rep and cap genes provided in-trans&#8212;i.e., on a separate, non-ITR containing plasmid that expresses regulatory and structural elements that then interact with the cis plasmid&#8212;and is thus called the trans plasmid. In addition to physically enclosing&#160;the VG, the capsid influences cellular tropism12,13. By providing the serotype-specific cap gene in-trans, researchers are easily able to maximize transduction efficiency by choosing an optimized capsid serotype for their given target cell. Lastly, as a Dependoparvovirus, AAV requires a helper virus to activate rep/cap expression from its viral promoters, achieved by adenoviral helper genes, provided on a third plasmid such as pAd&#916;F614,15. After 72 h of triple-plasmid transfection, the vector can be released from producer cells into the culture media by repeated freeze/thaw cycles. The entire plate contents are then collected, and large cellular debris is removed by centrifugation; the resulting media supernatant is a crude rAAV preparation ready for downstream transductions.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Overview of crude rAAV vector production. Crude rAAV production and transduction can be accomplished within 5 days. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
rAAV may be more favorable for transgene delivery compared to other transfection methods, which are commonly associated with cellular toxicity, low efficiency, and expensive reagents and equipment, such as for electroporation or chemical/lipid-based transfection16,17. rAAV bypasses these obstacles and often provides potent transgene expression with minimal toxicity, and minimal hands-on time. Importantly, producing rAAV and applying it in cell culture is simple and rarely requires purification of the vector from the culture media (Figure 1). Additionally, rAAV does not integrate its VG into the host genome, unlike Lentiviral transgene delivery, and thus lowers the risk of insertional mutagenesis18. Despite the potential benefits of using rAAV for transgene delivery, limitations must be considered. Importantly, the size of the transgene, including the ITRs, should not exceed 4.9 kb due to physical constraints of the capsid, thereby limiting a researcher&#39;s ability to effectively deliver large regulatory elements and transgenes. Furthermore, since rAAV is a non-integrating virus, transduction results in transient transgene expression in dividing cells and may not be practical for stable expression. However, methods using dual rAAV-delivered Cas9 and homology-directed repair (HDR) templates may be used to stably insert sequences at specific genomic loci if a researcher wishes19.

Yazar Gündemi: Hücre Kültürü Araştırmalarında Saflaştırılmamış Rekombinant AAV'lerin Potansiyelinin Ortaya Çıkarılması 

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Gene therapy uses a viral capsid to introduce DNA into cells, and then the cells process that DNA through mechanisms that aren't fully understood. By studying how the cell processes AAV delivered DNA, we hope to improve safety, efficacy and longevity of AAV gene therapies. Studying AAV DNA processing at the tissue or organism level was quite difficult.And while we were developing cell culture transduction protocols for AAV visualization via super resolution microscopy, we found that the simplicity of producing and using unpurified AAV preparations in cell culture is not well known. This straightforward method for transient expression can be advantageous for researchers in numerous fields. Creating crude AAV preparations is quite simple, and they have a long shelf life F4C, allowing them to be used in numerous experiments.Applying them is simple, making them a time and cost-effective alternative to standard transfection reagents. Often AAV crude preparations are more efficient and less toxic than transfection. Vectrology has two arms, production and transduction, and both are entirely dependent on host cellular machinery.Our future research aims to identify the cellular machinery involved in these processes and ways to manipulate them so that we can improve production and transduction efficiency. Understanding the basic biology underpinning both arms of vectrology is vital for the success of gene therapies.

İlgilenilen kültürlenmiş hücrelerin transdüksiyonu için en uygun kapsidin bulunması Çeşitli kapsid serotiplerinin tropizmini belirlemek için çeşitli hücre tipleri transdüksiyon yapılmıştır (Şekil 5). Doğal serotipler AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 ve tasarlanmış kapsid varyantları Anc80 25, DJ26,LK03 27 veKP1 28, bu protokolde sağlanan yöntemler kullanılarak klonlanan bir CMV promotörü altında mScarlet'i eksprese eden bir vektör genomu ile paketlendi. Titre edilmemiş ham vektör preparatları uygun kültür ortamında seyreltildi ve hücreler 24+ saat boyunca transdüksiyona tabi tutuldu ve görüntülendi (Şekil 5B). Transdüksiyon verimliliği, mScarlet + olan toplam hücrelerin oranı veya mScarlet + olan tek bir z düzlemindeki hücrelerin oranı ile hesaplandı (fare ince bağırsak organoidleri için; Şekil 5C). Transdüksiyon verimlilikleri (mScarlet+ hücreleri) farklılaşmış C2C12 ve HSkMC miyotüpleri için değil, farklılaşmamış C2C12 ve HSkMC miyoblastları için sağlanır (Şekil 5A).
AAV2 ve KP1, test edilen hücre hatları arasında en güçlü serotiplerdi (Şekil 5A). Farklı türlerden kaynaklanan benzer hücre tiplerinin farklı verimliliklerde transdüksiyona uğradığı da gözlenmiştir. Örneğin, Hepa1-6 (murin kaynaklı bir karaciğer hücresi hattı), AAV2 kullanıldığında Huh7'ye (insan kaynaklı bir karaciğer hücresi hattı) kıyasla transdüksiyonda belirgin bir azalma sergiler (Şekil 5B). Ayrıca, transdüksiyon sırasında farklı medya koşulları önemli bir rol oynar. Transdüksiyon öncesi ortamda kültürlenen fare ince bağırsak organoidleri (mSIO'lar), organoid büyüme ortamında kültürlenenlere kıyasla daha az etkili bir şekilde transdüksiyona uğrar (Şekil 5C). Ek olarak, AAV2, farklılaşmamış HSkMC miyoblastlarını ve farklılaşmış HSkMC miyotüplerini verimli bir şekilde dönüştürür (Şekil 5B), ancak miyotüplerin kantitatif analizi zordur ve bu nedenle sağlanmaz.
Şekil 5'te çeşitli hücre tipleri için gözlemlenen yüksek transdüksiyon verimlilikleri, ham vektör preparatlarının, saflaştırma ve titrasyon gibi daha ileri adımlar olmadan çeşitli hücre tiplerini transdüksiyon etmek için etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, transgen iletimini en üst düzeye çıkarmak için bir kapsid seçerken dikkatli bir şekilde düşünülmelidir. Diğer birçok hücre dizisi ve kapsid daha önce test edilmiş ve saflaştırılmış vektör preparatları ile birlikte yayınlanmıştır12.
Ortam koşullarının vektör parçacığından bağımsız bir etkisi, iletimin verimliliğini etkileyebilir. Bununla birlikte, tropizmin (yani, vektörün hücre tipine özgü alımı ve ekspresyonu) kapsid spesifik bir özellik olduğu genel olarak kabul edilmektedir29. Doz uyumlu ham ve saflaştırılmış preparatlar arasındaki karşılaştırmanın hücresel tropizmi etkilediği henüz gözlenmemiştir. Bu nedenle, ham vektör preparatları, hücre kültüründe saflaştırılmış vektörlere benzer şekilde kullanılabilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg"> Şekil 5: Çeşitli hücre tiplerinin ham vektör iletimi . (A) Bir mScarlet transgeni içeren çeşitli AAV vektörlerinin eklenmesini takiben mScarlet + yüzdesi. (B) AAV serotip 2'den verilen mScarlet'i eksprese eden hücreler. Ölçek çubukları: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 ve HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Kısaltmalar: hpt = transdüksiyondan sonraki saat. (C) Fare ince bağırsak organoidleri (mSIO'lar) ya transdüksiyon öncesi ortamda ya da organoid büyüme ortamında rAAV ile tedavi edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Üçlü plazmit transfeksiyonu çalışma sayfası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: PEI optimizasyon çalışma sayfası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Potential of Unpurified Recombinant AAVs in Cell Culture Research at JoVE.com

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

Gen terapisi, DNA'yı hücrelere sokmak için viral bir kapsid kullanır ve daha sonra hücreler bu DNA'yı tam olarak anlaşılmayan mekanizmalar aracılığıyla işler. Hücrenin AAV'nin DNA'yı nasıl işlediğini inceleyerek, AAV gen terapilerinin güvenliğini, etkinliğini ve uzun ömürlülüğünü artırmayı umuyoruz. AAV DNA işlemeyi doku veya organizma düzeyinde incelemek oldukça zordu.Süper çözünürlüklü mikroskopi ile AAV görselleştirme için hücre kültürü transdüksiyon protokolleri geliştirirken, hücre kültüründe saflaştırılmamış AAV preparatlarının üretilmesinin ve kullanılmasının basitliğinin iyi bilinmediğini gördük. Geçici ifade için bu basit yöntem, birçok alandaki araştırmacılar için avantajlı olabilir. Ham AAV preparatları oluşturmak oldukça basittir ve uzun raf ömrüne sahip F4C'ye sahiptirler ve bu da çok sayıda deneyde kullanılmalarına izin verir.Bunları uygulamak basittir, bu da onları standart transfeksiyon reaktiflerine zaman ve maliyet açısından etkin bir alternatif haline getirir. Genellikle AAV ham preparatları, transfeksiyondan daha verimli ve daha az toksiktir. Vektrolojinin üretim ve transdüksiyon olmak üzere iki kolu vardır ve her ikisi de tamamen konakçı hücresel makinelere bağlıdır.Gelecekteki araştırmamız, bu süreçlerde yer alan hücresel makineleri ve bunları manipüle etmenin yollarını belirlemeyi amaçlamaktadır, böylece üretim ve iletim verimliliğini artırabiliriz. Vektrolojinin her iki kolunu da destekleyen temel biyolojiyi anlamak, gen terapilerinin başarısı için hayati önem taşır.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Abstract