Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Summary

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Abstract

A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.

Introduction

O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita ^5,6

Protocol

Este protocolo usa camundongos machos nus de 4 semanas de idade. Aloja quatro ratos em uma gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22−24 °C e 50%−70% de umidade relativa. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (ID de aprovação: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparação de tampões e reagentes

Discussion

O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo³⁸. Al?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332