Isolering og oprensning af bakterielle ekstracellulære vesikler fra human afføring ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering

Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er) er nanovesikler afledt af bakterier, der spiller en aktiv rolle i bakterie-bakterier og bakterie-værtskommunikation, der overfører bioaktive molekyler såsom proteiner, lipider og nukleinsyrer arvet fra moderbakterierne. BEV'er afledt af tarmmikrobiota har virkninger i mave-tarmkanalen og kan nå fjerne organer, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for fysiologi og patologi. Teoretiske undersøgelser, der udforsker typer, mængder og roller af BEV'er afledt af menneskelig afføring, er afgørende for at forstå udskillelsen og funktionen af BEV'er fra tarmmikrobiotaen. Disse undersøgelser kræver også en forbedring af den nuværende strategi for isolering og rensning af BEV'er.

Denne undersøgelse optimerede isolerings- og rensningsprocessen for BEV'er ved at etablere to densitetsgradientcentrifugeringstilstande (DGC): Top-down og Bottom-up. Den berigede fordeling af BEV'er blev bestemt i fraktionerne 6 til 8 (F6-F8). Effektiviteten af tilgangen blev evalueret baseret på partikelmorfologi, størrelse, koncentration og proteinindhold. Partikel- og proteingenvindingshastighederne blev beregnet, og tilstedeværelsen af specifikke markører blev analyseret for at sammenligne genvinding og renhed af de to DGC-tilstande. Resultaterne viste, at Top-down-centrifugeringstilstanden havde lavere kontamineringsniveauer og opnåede en genvindingshastighed og renhed svarende til bottom-up-tilstanden. En centrifugeringstid på 7 timer var tilstrækkelig til at opnå en fækal BEV-koncentration på 10⁸/mg.

Bortset fra afføring kan denne metode anvendes på andre kropsvæsketyper med korrekt modifikation i henhold til forskellene i komponenter og viskositet. Afslutningsvis vil denne detaljerede og pålidelige protokol lette den standardiserede isolering og oprensning af BEV'er og dermed lægge et fundament for efterfølgende multi-omics-analyse og funktionelle eksperimenter.