Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом исследовании описывается метод выделения и очистки бактериальных внеклеточных везикул (БЭВ), обогащенных из фекалий человека с помощью центрифугирования с градиентом плотности (ДГК), определяются физические характеристики БЭВ с точки зрения морфологии, размера частиц и концентрации, а также обсуждаются потенциальные применения подхода ДГК в клинических и научных исследованиях.

Abstract

Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) — это нановезикулы, полученные из бактерий, которые играют активную роль в коммуникации бактерии-бактерии и бактерии-хозяина, перенося биологически активные молекулы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, унаследованные от родительских бактерий. БЭВ, полученные из микробиоты кишечника, оказывают воздействие на желудочно-кишечный тракт и могут достигать отдаленных органов, что приводит к значительным последствиям для физиологии и патологии. Теоретические исследования, изучающие типы, количества и роль БЭВ, полученных из фекалий человека, имеют решающее значение для понимания секреции и функции БЭВ из микробиоты кишечника. Эти исследования также требуют совершенствования существующей стратегии по изоляции и очистке БЭВ.

В этом исследовании оптимизирован процесс изоляции и очистки электромобилей путем установления двух режимов центрифугирования с градиентом плотности (DGC): сверху вниз и снизу вверх. Обогащенное распределение БЭВ определяли во фракциях от 6 до 8 (F6-F8). Эффективность подхода оценивалась на основе морфологии частиц, размера, концентрации и содержания белка. Были рассчитаны скорости извлечения частиц и белков, а также проанализировано наличие специфических маркеров для сравнения восстановления и чистоты двух режимов ДГК. Результаты показали, что режим центрифугирования «Сверху вниз» имеет более низкие уровни загрязнения и обеспечивает скорость восстановления и чистоту, аналогичные режиму «Снизу вверх». Время центрифугирования 7 ч было достаточным для достижения концентрации фекальных БЭВ 108/мг.

Помимо фекалий, этот метод может быть применен и к другим типам жидкостей организма с соответствующей модификацией в соответствии с различиями в компонентах и вязкости. В заключение, этот подробный и надежный протокол облегчит стандартизированную изоляцию и очистку БЭВ и, таким образом, заложит основу для последующего мультиомиксного анализа и функциональных экспериментов.

Introduction

Кишечник широко признан органом, содержащим самые многочисленные микробные сообщества в организме человека, причем более 90% бактерий участвуют в колонизации и размножении 1,2. Обширные данные свидетельствуют о том, что микробиота кишечника модулирует микроокружение кишечника и одновременно взаимодействует с дисфункцией отдаленных органов, в первую очередь через нарушение кишечного барьера 3,4. Появляется все больше данных, указывающих на корреляцию между дисбалансом микробиоты кишечника и прогрессированием воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)5,6....

Protocol

Комитет по этике больницы Наньфан Южного медицинского университета санкционировал это исследование, которое проводилось с информированного согласия участников. Все методы, используемые в настоящем документе, соответствуют стандартным операционным рекомендациям, предоставленным М?.......

Representative Results

Определение распределения фракций, обогащенных BEV
Для определения распределения фракций, обогащенных внеклеточными везикулами бактерий (БЭВ), был установлен холостой контроль для измерения значений абсорбции при ОД 340 нм, а плотность каждой фракции рассчитывалась на основе.......

Discussion

Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) представляют собой липидно-бислойные наночастицы, секретируемые бактериями, несущие множество белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул, способствующих опосредованию функциональных эффектов бактерий

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (82025024); Ключевой проект Национального фонда естественных наук Китая (82230080); Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA1300604); Национальный фонд естественных наук Китая (81871735, 82272438 и 82002245); Гуандунский фонд естественных наук для выдающихся молодых ученых (2023B1515020058); Фонд естественных наук провинции Гуандун (2021A1515011639); Крупная государственная программа развития фундаментальных исследований Фонда естественных нау....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)ACMECAP1126Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)Sigma-AldrichM7027Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)Polysciences21447-25Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL PipetteKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)Fdbio scienceFD0030Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading bufferFdbio scienceFD006Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcoholLIRCONLIRCON-500 mLSurface disinfection
96-well plateRarA8096Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibodyAbcamab92573Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibodyAbcamab134045Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibodyAbcamab236630Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibodySino Biological40067-MM06Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibodyAbcamab30394Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibodyThermo FisherMA1-83152Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibodyThermo Fisher MA1-7402Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibodyCUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibodyAbcamab133267Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibodyAbcamab125011Western blotting (Primary Antibody)
AutoclaveZEALWAYGR110DPSterilization for supplies and mediums used in the experiment
BalanceMettler ToledoAL104Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay Fdbio scienceFD2001Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comMake the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinetHaierHR1200- II B2Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence ApparatusBIO-OIOI600SE-MFUsed in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5BioTekF01Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoproteinACMECAC12038Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipmentBio-rad1658033Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP Fdbio scienceFD8020Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli American Type Culture CollectionATCC8739Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mLKIRGENKG2811Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paperBiosharpBS-TFP-070BMorphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powderMeilunbioMB6078Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio scienceFDR007Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shakerQiangwenDHZ-LCultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task WipesKimtech Science34155Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB brothHopebioHB0128Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C)HaierDW-86L338JStore the samples
MethanolAlalddinM116118Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mLKIRGENKG2211Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mLKIRGENKG2911Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mLBBIF610888-0001Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader Thermo Fisher Multiskan MK3Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μmMerck milliporeSLGP033RBFiltration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaClGHTECH1.01307.040Density gradient centrifugation solution
NaOHGHTECH1.01394.068Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100Beckman CoulterA94469Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893Density gradient centrifugation stock solution
Orbital ShakerYouningCS-100Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered salineProcellPB180327Dissolve feces at Step 2
PipettorEppendorf3120000267, 3120000259Transfer the solution
Plastic pasteur pipetteABCbioABC217003-4Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010, IPVH00010Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 WellsACEF15420GelUsed in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluentFdbio scienceFD0040Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladderFdbio scienceFD0672Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solutionUBIOUW0500Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLTransfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powderFdbio scienceFD1021Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)Hitachi H-7650Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tubeBeckman326823, 355642Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean benchAIRTECHSW-CJ-2FDPeform the procedures about liquid handling
Water bathBluepardCU600Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

References

  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved