A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом исследовании описывается метод выделения и очистки бактериальных внеклеточных везикул (БЭВ), обогащенных из фекалий человека с помощью центрифугирования с градиентом плотности (ДГК), определяются физические характеристики БЭВ с точки зрения морфологии, размера частиц и концентрации, а также обсуждаются потенциальные применения подхода ДГК в клинических и научных исследованиях.
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) — это нановезикулы, полученные из бактерий, которые играют активную роль в коммуникации бактерии-бактерии и бактерии-хозяина, перенося биологически активные молекулы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, унаследованные от родительских бактерий. БЭВ, полученные из микробиоты кишечника, оказывают воздействие на желудочно-кишечный тракт и могут достигать отдаленных органов, что приводит к значительным последствиям для физиологии и патологии. Теоретические исследования, изучающие типы, количества и роль БЭВ, полученных из фекалий человека, имеют решающее значение для понимания секреции и функции БЭВ из микробиоты кишечника. Эти исследования также требуют совершенствования существующей стратегии по изоляции и очистке БЭВ.
В этом исследовании оптимизирован процесс изоляции и очистки электромобилей путем установления двух режимов центрифугирования с градиентом плотности (DGC): сверху вниз и снизу вверх. Обогащенное распределение БЭВ определяли во фракциях от 6 до 8 (F6-F8). Эффективность подхода оценивалась на основе морфологии частиц, размера, концентрации и содержания белка. Были рассчитаны скорости извлечения частиц и белков, а также проанализировано наличие специфических маркеров для сравнения восстановления и чистоты двух режимов ДГК. Результаты показали, что режим центрифугирования «Сверху вниз» имеет более низкие уровни загрязнения и обеспечивает скорость восстановления и чистоту, аналогичные режиму «Снизу вверх». Время центрифугирования 7 ч было достаточным для достижения концентрации фекальных БЭВ 108/мг.
Помимо фекалий, этот метод может быть применен и к другим типам жидкостей организма с соответствующей модификацией в соответствии с различиями в компонентах и вязкости. В заключение, этот подробный и надежный протокол облегчит стандартизированную изоляцию и очистку БЭВ и, таким образом, заложит основу для последующего мультиомиксного анализа и функциональных экспериментов.
Кишечник широко признан органом, содержащим самые многочисленные микробные сообщества в организме человека, причем более 90% бактерий участвуют в колонизации и размножении 1,2. Обширные данные свидетельствуют о том, что микробиота кишечника модулирует микроокружение кишечника и одновременно взаимодействует с дисфункцией отдаленных органов, в первую очередь через нарушение кишечного барьера 3,4. Появляется все больше данных, указывающих на корреляцию между дисбалансом микробиоты кишечника и прогрессированием воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)5,6....
Комитет по этике больницы Наньфан Южного медицинского университета санкционировал это исследование, которое проводилось с информированного согласия участников. Все методы, используемые в настоящем документе, соответствуют стандартным операционным рекомендациям, предоставленным М?.......
Определение распределения фракций, обогащенных BEV
Для определения распределения фракций, обогащенных внеклеточными везикулами бактерий (БЭВ), был установлен холостой контроль для измерения значений абсорбции при ОД 340 нм, а плотность каждой фракции рассчитывалась на основе.......
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) представляют собой липидно-бислойные наночастицы, секретируемые бактериями, несущие множество белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул, способствующих опосредованию функциональных эффектов бактерий
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (82025024); Ключевой проект Национального фонда естественных наук Китая (82230080); Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA1300604); Национальный фонд естественных наук Китая (81871735, 82272438 и 82002245); Гуандунский фонд естественных наук для выдающихся молодых ученых (2023B1515020058); Фонд естественных наук провинции Гуандун (2021A1515011639); Крупная государственная программа развития фундаментальных исследований Фонда естественных нау....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved