Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

Abstract

עור העופות המתפתח במהלך האמבריוגנזה הוא מודל ייחודי שיכול לספק תובנות חשובות על דפוסי רקמות. כאן מתוארות שלוש וריאציות על תרביות צמחי עור כדי לבחון היבטים שונים של התפתחות העור. ראשית, תרביות איברים ומניפולציות אקס ויו מציעות לחוקרים הזדמנויות להתבונן ולחקור את התפתחות ניצני הנוצות ישירות. תרבית צמחי העור יכולה לגדול במשך 7 ימים, מה שמאפשר ניתוח ישיר של התנהגות התא והדמיה 4D במרווחי זמן במהלך תקופת גדילה זו. זה גם מאפשר מניפולציות פיזיות ומולקולריות של תנאי תרבית כדי לדמיין את תגובת הרקמות. לדוגמה, ניתן ליישם חרוזים מצופים בגורם גדילה באופן מקומי כדי לגרום לשינויים בדוגמת הנוצות באזור מוגבל. לחלופין, התמרה ויראלית יכולה להיות מועברת ברחבי העולם במדיה התרבית כדי להעלות או להוריד את ביטוי הגנים. שנית, פרוטוקול רקומבינציית העור מאפשר לחוקרים לחקור אינטראקציות רקמה בין האפידרמיס למזנכימה שמקורן באזורי עור שונים, שלבי חיים שונים או ממינים שונים. זה נותן הזדמנות לבחון את חלון הזמן שבו האפיתל מוכשר להגיב לאותות ואת יכולתו ליצור נספחי עור שונים בתגובה לאותות ממקורות מזנכימליים שונים. שלישית, בנייה מחדש של העור באמצעות תאי עור מנותקים המכוסים באפיתל שלם מאפסת את התפתחות העור ומאפשרת לחקור את התהליכים הראשוניים של דפוסים תקופתיים. גישה זו גם משפרת את יכולתנו לתמרן את ביטוי הגנים בין התאים המנותקים לפני יצירת צמח העור המשוחזר. מאמר זה מספק את שלושת פרוטוקולי התרבות וניסויים לדוגמה כדי להדגים את תועלתם.

Introduction

התפתחות עור עובר העופות היא מודל מצוין לחקר מנגנוני המורפוגנזה בגלל הדפוסים השונים והנגישות למיקרו-כירורגיה ומניפולציה 1,2. עם זאת, הערכת אירועים תאיים ומולקולריים ברקמות שלמות יכולה להיות קשה מכיוון שנוכחות של רקמות חיצוניות יכולה לסבך תצפיות מיקרוסקופיות. יתר על כן, היכולת לתמרן ביטוי גנים כדי לבחון את תפקידם במורפוגנזה של העור אינה תמיד משימה פשוטה. אנו מוצאים שאנו יכולים לבדוק תפקודי גנים באמצעות התמרה רטרו-ויראלית עם שיעור הצלחה גבוה יותר באמצעות מודלים של צמחי עור. כאן אנו דנים ביתרונות של שלושה מודלים explant העור שפותחו.

תרבית עור עופות עוברית היא מערכת רבת ....

Protocol

1. תרבית צמחילת עור עוף (איור 1)

  1. לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולשלב אותן על פי המבורגר והמילטון14.
    1. בשלב 28 (~E5.5), הספרה השנייה והבוהן השלישית של הגפה ארוכות יותר מהאחרות; שלוש ספרות וארב.......

Representative Results

תרביות צמחי עור
התפתחות ניצני נוצות מתרביות איברי עור ex vivo ניתן לצפות ישירות תחת המיקרוסקופ. באמצעות מודל תרבית צמחי העור של עור הגב בשלב 30 של עוף, הפלקודים נראים לאורך קו האמצע. לאחר מכן החזית המורפוגנטית מתפשטת בהדרגה לרוחב לכיוון פריפריית העור עם היווצרות פרימורדיה חדשה.......

Discussion

רקומבינציה רקמות מספק בדיקה כדי לחקור את התרומות הייחודיות של אפיתל ו mesenchyme. בתרנגולות, הנוצות מתחילות להתפתח ביום העוברי 7 (E7) ואילו הקשקשים מתחילים ב-E9. כאשר מזנכימה בקנה מידה E9 משולבת מחדש עם אפיתל נוצות E7, הרקמה המשולבת מחדש יוצרת קשקשים, וכאשר מזנכימה נוצה E7 משולבת מחדש עם נוצות אפיתל ב?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 ו-RO1 AR078050. העבודה נתמכת גם על ידי חוזה מחקר משותף בין USC והאוניברסיטה הרפואית של סין בטייוואן. אנו מודים למחלקת USC BISC 480 Developmental Biology 2023 על בדיקה מוצלחת של פרוטוקול תרבית עור עופות זה במהלך מספר מודולי מעבדה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well culture dish FalconREF 353502Air-Liquid Interface (ALI) Cultures  
Cell culture inset FalconREF 353090.0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1Worthington BiochemicalLS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Corning10-013-CV4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Fetal bovine serumThermoFisher16140-071
GlucoseSigma-AldrichG8270
Hanks’s buffered saline solutionGibco14170-112No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin Gibco15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP5379
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014
Sodium chloride (Nacl)EMD CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS0751
TrypsinGibco27250-042

References

  1. Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
  2. Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
  3. Dhouailly, D., Wilehm Roux, .

Explore More Articles

4D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved