שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

Abstract

עור העופות המתפתח במהלך האמבריוגנזה הוא מודל ייחודי שיכול לספק תובנות חשובות על דפוסי רקמות. כאן מתוארות שלוש וריאציות על תרביות צמחי עור כדי לבחון היבטים שונים של התפתחות העור. ראשית, תרביות איברים ומניפולציות אקס ויו מציעות לחוקרים הזדמנויות להתבונן ולחקור את התפתחות ניצני הנוצות ישירות. תרבית צמחי העור יכולה לגדול במשך 7 ימים, מה שמאפשר ניתוח ישיר של התנהגות התא והדמיה 4D במרווחי זמן במהלך תקופת גדילה זו. זה גם מאפשר מניפולציות פיזיות ומולקולריות של תנאי תרבית כדי לדמיין את תגובת הרקמות. לדוגמה, ניתן ליישם חרוזים מצופים בגורם גדילה באופן מקומי כדי לגרום לשינויים בדוגמת הנוצות באזור מוגבל. לחלופין, התמרה ויראלית יכולה להיות מועברת ברחבי העולם במדיה התרבית כדי להעלות או להוריד את ביטוי הגנים. שנית, פרוטוקול רקומבינציית העור מאפשר לחוקרים לחקור אינטראקציות רקמה בין האפידרמיס למזנכימה שמקורן באזורי עור שונים, שלבי חיים שונים או ממינים שונים. זה נותן הזדמנות לבחון את חלון הזמן שבו האפיתל מוכשר להגיב לאותות ואת יכולתו ליצור נספחי עור שונים בתגובה לאותות ממקורות מזנכימליים שונים. שלישית, בנייה מחדש של העור באמצעות תאי עור מנותקים המכוסים באפיתל שלם מאפסת את התפתחות העור ומאפשרת לחקור את התהליכים הראשוניים של דפוסים תקופתיים. גישה זו גם משפרת את יכולתנו לתמרן את ביטוי הגנים בין התאים המנותקים לפני יצירת צמח העור המשוחזר. מאמר זה מספק את שלושת פרוטוקולי התרבות וניסויים לדוגמה כדי להדגים את תועלתם.

Introduction

התפתחות עור עובר העופות היא מודל מצוין לחקר מנגנוני המורפוגנזה בגלל הדפוסים השונים והנגישות למיקרו-כירורגיה ומניפולציה ^1,2. עם זאת, הערכת אירועים תאיים ומולקולריים ברקמות שלמות יכולה להיות קשה מכיוון שנוכחות של רקמות חיצוניות יכולה לסבך תצפיות מיקרוסקופיות. יתר על כן, היכולת לתמרן ביטוי גנים כדי לבחון את תפקידם במורפוגנזה של העור אינה תמיד משימה פשוטה. אנו מוצאים שאנו יכולים לבדוק תפקודי גנים באמצעות התמרה רטרו-ויראלית עם שיעור הצלחה גבוה יותר באמצעות מודלים של צמחי עור. כאן אנו דנים ביתרונות של שלושה מודלים explant העור שפותחו.

תרבית עור עופות עוברית היא מערכת רבת ....

Protocol

1. תרבית צמחילת עור עוף (איור 1)

1. לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולשלב אותן על פי המבורגר והמילטון¹⁴.
   1. בשלב 28 (~E5.5), הספרה השנייה והבוהן השלישית של הגפה ארוכות יותר מהאחרות; שלוש ספרות וארב.......

Discussion

רקומבינציה רקמות מספק בדיקה כדי לחקור את התרומות הייחודיות של אפיתל ו mesenchyme. בתרנגולות, הנוצות מתחילות להתפתח ביום העוברי 7 (E7) ואילו הקשקשים מתחילים ב-E9. כאשר מזנכימה בקנה מידה E9 משולבת מחדש עם אפיתל נוצות E7, הרקמה המשולבת מחדש יוצרת קשקשים, וכאשר מזנכימה נוצה E7 משולבת מחדש עם נוצות אפיתל ב?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042