Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Summary

Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.

Abstract

Lo sviluppo della pelle aviaria durante l'embriogenesi è un modello unico in grado di fornire preziose informazioni sulla modellazione dei tessuti. Qui vengono descritte tre variazioni sulle colture di espianti cutanei per esaminare diversi aspetti dello sviluppo cutaneo. In primo luogo, le colture e le manipolazioni di organi ex vivo offrono ai ricercatori l'opportunità di osservare e studiare direttamente lo sviluppo dei boccioli di piume. La coltura di espianti cutanei può crescere per 7 giorni, consentendo l'analisi diretta del comportamento cellulare e l'imaging 4D a intervalli durante questo periodo di crescita. Ciò consente anche manipolazioni fisiche e molecolari delle condizioni di coltura per visualizzare la risposta dei tessuti. Ad esempio, le perle rivestite con fattore di crescita possono essere applicate localmente per indurre cambiamenti nel disegno delle piume in un'area limitata. In alternativa, la trasduzione virale può essere somministrata a livello globale nei terreni di coltura per aumentare o diminuire l'espressione genica. In secondo luogo, il protocollo di ricombinazione cutanea consente ai ricercatori di studiare le interazioni tissutali tra l'epidermide e il mesenchima che derivano da diverse regioni della pelle, diverse fasi di vita o diverse specie. Ciò offre l'opportunità di testare la finestra temporale in cui l'epitelio è competente a rispondere ai segnali e la sua capacità di formare diverse appendici cutanee in risposta a segnali provenienti da diverse fonti mesenchimali. In terzo luogo, la ricostituzione della pelle utilizzando cellule dermiche dissociate sovrapposte a epitelio intatto ripristina lo sviluppo della pelle e consente lo studio dei processi iniziali di patterning periodico. Questo approccio migliora anche la nostra capacità di manipolare l'espressione genica tra le cellule dissociate prima di creare l'espiante cutaneo ricostituito. Questo documento fornisce i tre protocolli di coltura ed esperimenti esemplari per dimostrarne l'utilità.

Introduction

Lo sviluppo della pelle degli embrioni aviari è un modello eccellente per studiare i meccanismi della morfogenesi a causa dei modelli distinti e dell'accessibilità alla microchirurgia e alla manipolazione ^1,2. Tuttavia, la valutazione degli eventi cellulari e molecolari nei tessuti intatti può essere difficile perché la presenza di tessuti estranei può complicare le osservazioni microscopiche. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica per testare il loro ruolo nella morfogenesi cutanea non è sempre un compito semplice. Scopriamo che possiamo testare le funzioni geniche utilizzando la trasduzione ....

Protocol

1. Coltura di espiantazione di pelle di pollo (Figura 1)

1. Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e metterle in scena secondo Hamburger e Hamilton¹⁴.
   1. Allo stadio 28 (~E5.5), il secondo dito e il terzo dito dell'arto sono più lunghi degli altri; Tre dita e quattro dita dei piedi sono distinte.
   2. Al punto 29 (~E6), l'ala è piegata all'altezza del gomito; La.......

Discussion

La ricombinazione tissutale fornisce un saggio per esplorare i contributi unici dell'epitelio e del mesenchima. Nei polli, le piume iniziano a svilupparsi al giorno embrionale 7 (E7) mentre le squame iniziano a E9. Quando il mesenchima della squama E9 viene ricombinato con l'epitelio della piuma E7, il tessuto ricombinato forma squame e quando il mesenchima della piuma E7 viene ricombinato con l'epitelio della squama E9 si formano¹¹ penne. Questi studi hanno dimostrato che il mesenchima controlla .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042