המחקרים וניקולאי ג'יי וור אלברכטסן נתמכו על ידי קרן נובו נורדיסק Excellence Emerging Investigator Grant - אנדוקרינולוגיה ומטבוליזם (Application No. NNF19OC0055001), פרס מנהיג העתיד של הקרן האירופית לחקר הסוכרת (NNF21SA0072746) וקרן המחקר העצמאית דנמרק, Sapere Aude (1052-00003B). מרכז נובו נורדיסק לחקר חלבונים נתמך כספית על ידי קרן נובו נורדיסק (הסכם מענק NNF14CC0001). איור 1B נוצר באמצעות biorender.com. אנו מודים לד"ר רונה א. קוהר (Novo Nordisk A/S) על דיונים פוריים על כבד עכבר מחורר.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באישור הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים, המשרד לאיכות הסביבה והמזון של דנמרק (היתר 2018-15-0201-01397), וועדת האתיקה המקומית בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU, המכונים הלאומיים לבריאות (פרסום מס' 85-3) ובהתאם להנחיות החקיקה הדנית המסדירה ניסויים בבעלי חיים (1987). זהו הלי?...

מודל זילוח כבד של עכבר באתרו לחקר תגובות מטבוליות למצעים

<ol>
	<li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response.">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329 (2016).</li><li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation.">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li><li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro.">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330 (2022).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq.">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function,+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures.">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).</li><li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass-based,+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+(vLAMPS)+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME/TOX.">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Barto&#353;ek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).</li><li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+liver:+conceptual+and+practical+considerations.">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li><li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates.">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li><li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage:+role+of+Ca2.">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li><li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation.">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li><li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium.">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li></ol>

כבד העכבר המבודד הוא כלי מחקר חזק לחקר הדינמיקה והמנגנונים המולקולריים של חילוף החומרים בכבד. האפשרות של איסוף דגימות מדקה לדקה מספקת הערכה מפורטת של ההשפעה הישירה של תרכובת בדיקה על הכבד. בהשוואה למחקרי in vivo, הכבד המחורר מאפשר לנו לחקור את חילוף החומרים בכבד באופן מבודד תוך הימנעות ?...

הכבד הוא איבר חיוני בחילוף החומרים. הוא ממלא תפקיד מפתח בשליטה על מאזן האנרגיה של כל הגוף על ידי ויסות חילוף החומרים של גלוקוז, שומנים וחומצות אמינו. העלייה במחלות כבד ברחבי העולם מסתמנת כנטל בריאותי עולמי גדול, ויש צורך בידע נוסף על הפתופיזיולוגיה והשלכותיה על תפקודי הכבד.
מודלים שונים במבחנה פותחו למחקר על הכבד כדי להשלים מחקרי in vivo. הפטוציטים ראשוניים מבודדים ומתורבתים ממכרסמים ובני אדם נמצאים בשימוש נרחב. תאים שאינם פרנכימליים יכולים להיות מופרדים מהפטוציטים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית והדרגתית, והתרבות המשותפת של סוגי תאים שונים שימושית לחקר crosstalkבין-תאי 1. למרות שהפטוציטים האנושיים הראשוניים נחשבים לתקן הזהב לבדיקת רעילות תרופות, מספר מחקרים הראו כי הפטוציטים מתמיינים במהירות בתרבית רקמה וכתוצאה מכך מאבדים תפקודי כבד 2,3,4. תרבית הפטוציטים במערכת ספרואידית תלת-ממדית משפרת את הדיפרנציאציה, יציבה יותר, ונראה כי היא מחקה את הכבד in vivo במידה גבוהה יותר מאשר מערכות התרבית הדו-ממדיות המסורתיות5. פרוסות כבד חתוכות במדויק הן מודל מבוסס היטב נוסף במבחנה השומר על ארכיטקטורת הרקמה שלמה ומכיל את התאים הלא פרנכימליים הנמצאים בכבד6. מודלים מתקדמים יותר במבחנה כוללים כבד על שבב7 ואורגנואידים בכבד8. עם זאת, עם כל הגישות הללו, יש אובדן של שלמות מבנית ודינמיקה זרימה, כולל זרימת ורידים פורטליים-כבדיים וקטוריאליים, אשר ככל הנראה משפיע על הכללה.
כבד החולדה המבודד תואר לראשונה על ידי קלוד ברנרד בשנת 18559, והוא עדיין משמש בתחומים מדעיים שונים למחקרים בביולוגיה של הכבד, טוקסיקולוגיה ופתופיזיולוגיה. היתרונות של הכבד המחורר בהשוואה למודלים במבחנה שהוזכרו לעיל כוללים שמירה על ארכיטקטורת הכבד, זרימת כלי הדם, קוטביות הפטוציטים והאזור, והאינטראקציות בין הפטוציטים לתאים שאינם פרנכימליים. בהשוואה למחקרי in vivo, הכבד המחורר מאפשר ללמוד את חילוף החומרים בכבד באופן מבודד תוך הימנעות מגורמים חוץ-כבדיים הנישאים על ידי הדם ועם שליטה מלאה על תנאי הניסוי. מספר שינויים נעשו כדי לשפר את מודל זילוח כבד חולדה במהלך השנים10,11,12,13. למרות שעכברים שימשו למחקרי כבד מחוררים מבודדים, פחות ספרות זמינה. כאן, אנו מציגים שיטה לזילוח באתרו של כבד העכבר על ידי קנולציה של הווריד הפורטלי והווריד הנבוב העל-כבד נחות כדי לחקור את התגובות המטבוליות החריפות והישירות למצעים מטבוליים ולהורמונים כפי שנמדדו בשפכים הורידיים של הכבד מכבד העכבר בזמן אמת.

hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model

לכבד יש תפקידים רבים, כולל מטבוליזם של חומרים מזינים. בניגוד למודלים אחרים של חקר הכבד במבחנה ו-in vivo , הכבד המבודד מחורר מאפשר ללמוד ביולוגיה של הכבד ומטבוליזם בכבד כולו עם ארכיטקטורה כבדית שלמה, המופרדת מהשפעת גורמים חוץ-כבדיים. זילוח כבד פותח במקור עבור חולדות, אך השיטה הותאמה גם לעכברים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזילוח באתרו של כבד העכבר. הכבד מחורר באופן מקדים דרך וריד הפורטל עם חיץ קרבס-הנסלייט ביקרבונט מחומצן, והפלט נאסף מהווריד הנבוב התחתון העל-כבד עם הידוק של הווריד הנבוב התחתון האינפרא-הפטי כדי לסגור את המעגל. באמצעות שיטה זו, ההשפעות הכבדיות הישירות של מתחם הבדיקה ניתן להעריך עם רזולוציית זמן מפורטת. תפקוד הכבד והכדאיות יציבים למשך 3 שעות לפחות, ומאפשרים הכללת בקרות פנימיות באותו ניסוי. אפשרויות הניסוי באמצעות מודל זה הן רבות ועשויות להסיק תובנה לגבי פיזיולוגיה של הכבד ומחלות כבד.

The liver is an essential organ in metabolism. It plays a key role in the control of whole-body energy balance by regulating glucose, lipid, and amino acid metabolism. The increase in liver diseases worldwide is emerging as a major global health burden, and more knowledge is needed about the pathophysiology and its consequences for liver functions.
Various in vitro models have been developed for research on the liver to complement in vivo studies. Isolated and cultured primary hepatocytes from rodents and humans are widely used. Non-parenchymal cells can be separated from hepatocytes using differential and gradient centrifugation, and the co-culture of different cell types is useful for studying intercellular crosstalk1. Although primary human hepatocytes are considered the golden standard for testing drug toxicity, several studies have shown that the hepatocytes rapidly dedifferentiate in tissue culture resulting in loss of hepatic functions2,3,4. Hepatocyte culture in a 3D spheroid system ameliorates the dedifferentiation, is more stable, and appears to mimic the liver in vivo to a higher degree than the traditional 2D culture systems5. Precision-cut liver slices are another well-established in vitro model that keeps the tissue architecture intact and contains the non-parenchymal cells present in the liver6. More advanced in vitro models include liver-on-a-chip7 and liver organoids8. However, with all these approaches, there is a loss of structural integrity and flow dynamics, including vectorial portal-hepatic vein flow, which likely impacts the generalizability.
The isolated perfused rat liver was first described by Claude Bernard in 18559, and is still used in various scientific fields for studies of liver biology, toxicology, and pathophysiology. Advantages of the perfused liver compared to the above-mentioned in vitro models include the maintenance of the hepatic architecture, the vascular flow, the hepatocyte polarity and zonation, and the interactions between hepatocytes and non-parenchymal cells. Compared to in vivo studies, the perfused liver allows the study of liver metabolism in an isolated manner avoiding extra-hepatic factors carried by the blood and with complete control over the experimental conditions. Several modifications have been made to improve the rat liver perfusion model over the years10,11,12,13. Although mice have been used for isolated perfused liver studies, less literature is available. Here, we present a method for in situ perfusion of the mouse liver by cannulation of the portal vein and the suprahepatic vena cava inferior to study the acute and direct metabolic responses to metabolic substrates and hormones as measured in the hepatic venous effluent from the mouse liver in real-time.

מחבר זרקור: חקירת הסתגלויות בכבד והתקדמות טרום סוכרתית במחלות כבד 

ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר

In our lab, we investigate how the liver responds to common, as well as rare liver diseases, and how these adaptation may predispose to a pre-diabetogenic state. The liver responds to changes in nutrient availability and concentrations of hormones with increased transcription of relevant genes, but importantly also, with acute and non-transcriptional regulation. With the perfused liver, we can quantify all aspects of metabolism, including the release of metabolites in a minute to minute resolution.Advantages of this technique compared to other in vitro models are that the liver is left in situ with an intact hepatic architecture. And that the liver is viable for at least three hours, allowing each mouse liver to be its own control. Lastly, increasing the translational relevance.Using the mouse perfused liver system, we are able to identify and characterize novel signaling cascade of the hormone glucagon. This may be important as glucagon, as well as other hormone, may play a vital role in the dysmetabolic conditions of the liver in patients with fatty liver disease and diabetes.

נדרש קו בסיס יציב כדי לקבוע אם גירוי או מצע מובילים לשחרור המולקולה המעניינת. איור 3A מראה דוגמה לניסוי מוצלח. ייצור אוריאה בכבד המחורר נמדד במרווחים של 2 דקות ומוצג כממוצע ± SEM. תקופות הבסיס שקדמו לכל אחת משתי תקופות הגירוי הן יציבות. ייצור האוראה הממוצע במ?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases at JoVE.com

כאן, אנו מציגים שיטה חזקה עבור זילוח באתרו של כבד העכבר כדי ללמוד את הרגולציה החריפה והישירה של חילוף החומרים בכבד מבלי להפריע לארכיטקטורה הכבדית אלא בהיעדר גורמים מחוץ לכבד.

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

במעבדה שלנו אנו חוקרים כיצד הכבד מגיב למחלות כבד נפוצות ונדירות, וכיצד הסתגלות זו עשויה לגרום למצב טרום סוכרתי. הכבד מגיב לשינויים בזמינות החומרים המזינים ובריכוזי ההורמונים עם שעתוק מוגבר של גנים רלוונטיים, אך חשוב מכך, גם עם ויסות חריף ולא שעתוק. עם הכבד המחורר, אנו יכולים לכמת את כל ההיבטים של חילוף החומרים, כולל שחרור מטבוליטים ברזולוציה של דקה עד דקה.היתרונות של טכניקה זו בהשוואה למודלים אחרים במבחנה הם שהכבד נשאר באתרו עם ארכיטקטורה כבדית שלמה. וכי הכבד הוא קיימא לפחות שלוש שעות, המאפשר לכל כבד עכבר להיות שליטה משלו. לבסוף, הגדלת הרלוונטיות התרגומית.באמצעות מערכת הכבד המחוררת של העכבר, אנו מסוגלים לזהות ולאפיין מפל איתות חדש של ההורמון גלוקגון. זה עשוי להיות חשוב כמו גלוקגון, כמו גם הורמונים אחרים, עשוי לשחק תפקיד חיוני בתנאים dysmetabolic של הכבד בחולים עם מחלת כבד שומני וסוכרת.

ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר

Abstract