이 연구와 Nicolai J. Wewer Albrechtsen은 Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism(Application No. NNF19OC0055001), 유럽 당뇨병 연구 재단 미래 지도자상(NNF21SA0072746) 및 덴마크 독립 연구 기금, Sapere Aude(1052-00003B). 노보 노디스크 재단 단백질 연구 센터(Center for Protein Research)는 노보 노디스크 재단(Novo Nordisk Foundation)의 재정 지원을 받고 있습니다(보조금 계약 NNF14CC0001). 그림 1B는 biorender.com 로 작성되었습니다. 관류된 쥐의 간에 대한 유익한 토론을 해주신 Dr. Rune E. Kuhre(Novo Nordisk A/S)에게 감사드립니다.

모든 동물실험은 덴마크 동물실험검사관, 덴마크 환경식품부(허가 2018-15-0201-01397) 및 현지 윤리위원회의 허가를 받아 EU 지침 2010/63/EU, 국립보건원(간행물 번호 85-3) 및 동물실험에 관한 덴마크 법률(1987)의 지침에 따라 수행되었습니다. 이것은 말기 절차이며 사인은 심부 마취 하에 횡격막의 출출 및 천공입니다.
1. 실험동물
<ol><li>원하는 균주, 연령 및 성별의 마?...

기질에 대한 대사 반응을 연구하기 위한 현장 마우스 간 관류 모델

<ol>
	<li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response.">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329 (2016).</li><li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation.">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li><li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro.">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330 (2022).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq.">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function,+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures.">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).</li><li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass-based,+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+(vLAMPS)+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME/TOX.">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Barto&#353;ek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).</li><li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+liver:+conceptual+and+practical+considerations.">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li><li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates.">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li><li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage:+role+of+Ca2.">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li><li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation.">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li><li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium.">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li></ol>

분리된 관류된 쥐의 간은 간 대사의 역학 및 분자 메커니즘 연구를 위한 강력한 연구 도구입니다. 분 단위 샘플 수집의 가능성은 간에 대한 테스트 화합물의 직접적인 효과에 대한 자세한 평가를 제공합니다. in vivo 연구와 비교했을 때, 관류된 간을 사용하면 혈액에 의해 운반되는 간외 인자를 피하고 실험 조건을 완벽하게 제어하면서 격리된 방식으로 간 대사를 연구할 수 있습니다. 분리?...

간은 신진대사에 필수적인 기관입니다. 포도당, 지질, 아미노산 대사를 조절하여 전신 에너지 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 전 세계적으로 간 질환의 증가는 주요 글로벌 건강 부담으로 부상하고 있으며 병태 생리학과 간 기능에 미치는 영향에 대한 더 많은 지식이 필요합니다.
in vivo 연구를 보완하기 위해 간 연구를 위해 다양한 in vitro 모델이 개발되었습니다. 설치류와 인간으로부터 분리되고 배양된 1차 간세포가 널리 사용됩니다. 비실질 세포는 차등 및 기울기 원심분리를 사용하여 간세포에서 분리할 수 있으며, 서로 다른 세포 유형의 공동 배양은 세포 간 누화1을 연구하는 데 유용합니다. 1차 인간 간세포는 약물 독성 테스트의 황금 표준으로 간주되지만, 여러 연구에 따르면 간세포는 조직 배양에서 빠르게 역분화되어 간 기능을 상실하는 것으로 나타났습니다 2,3,4. 3D 스페로이드 시스템에서의 간세포 배양은 역분화를 개선하고, 더 안정적이며, 기존의 2D 배양 시스템보다 생체 내에서 간을 더 높은 수준으로 모방하는 것으로 보인다5. 정밀하게 절단된 간 절편은 조직 구조를 그대로 유지하고 간에 존재하는 비실질 세포를 포함하는 또 다른 잘 정립된 체외 모델이다6. 보다 발전된 in vitro 모델에는 liver-on-a-chip7 및 간 오가노이드8가 포함됩니다. 그러나 이러한 모든 접근 방식에서는 벡터 문맥-간 정맥 흐름을 포함한 구조적 무결성 및 흐름 역학이 손실되어 일반화 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
분리된 관류된 쥐의 간은 1855년 클로드 베르나르(Claude Bernard)에 의해 처음 기술되었으며, 9 간생물학, 독성학 및 병태생리학 연구를 위해 다양한 과학 분야에서 여전히 사용되고 있다. 위에서 언급한 시험관 내 모델과 비교하여 관류된 간의 장점에는 간 구조, 혈관 흐름, 간세포 극성 및 구역화, 간세포와 비실질 세포 간의 상호 작용이 유지됩니다. in vivo 연구와 비교했을 때, 관류된 간은 혈액에 의해 운반되는 간외 인자를 피하고 실험 조건을 완벽하게 제어하면서 격리된 방식으로 간 대사를 연구할 수 있습니다. 수년에 걸쳐 쥐의 간 관류 모델을 개선하기 위해 몇 가지 수정이 이루어졌습니다10,11,12,13. 쥐가 분리된 관류 간 연구에 사용되었지만, 문헌은 적습니다. 여기에서는 실시간으로 생쥐 간에서 배출되는 간에서 측정된 대사 기질 및 호르몬에 대한 급성 및 직접적인 대사 반응을 연구하기 위해 문맥 및 하대정맥의 캐뉼레이션에 의한 생쥐 간의 제자리 관류를 위한 방법을 제시합니다.

hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model

간은 영양소 대사를 포함한 다양한 기능을 가지고 있습니다. 간 연구의 다른 시험관 및 생체 내 모델과 달리 분리된 관류된 간은 간외 요인의 영향에서 분리된 온전한 간 구조로 전체 간의 간 생물학 및 대사를 연구할 수 있습니다. 간 관류는 원래 쥐를 위해 개발되었지만 이 방법은 쥐에도 적용되었습니다. 여기서는 마우스 간의 in situ 관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 간은 산소가 공급된 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액으로 문맥을 통해 전위적으로 관류되고, 출력은 회로를 닫기 위해 하대정맥을 클램핑하여 상하정맥에서 수집됩니다. 이 방법을 사용하면 테스트 화합물의 직접적인 간 효과를 자세한 시간 분해능으로 평가할 수 있습니다. 간 기능 및 생존력은 최소 3시간 동안 안정적이므로 동일한 실험에서 내부 대조군을 포함할 수 있습니다. 이 모델을 사용한 실험 가능성은 무궁무진하며 간 생리학 및 간 질환에 대한 통찰력을 추론할 수 있습니다.

The liver is an essential organ in metabolism. It plays a key role in the control of whole-body energy balance by regulating glucose, lipid, and amino acid metabolism. The increase in liver diseases worldwide is emerging as a major global health burden, and more knowledge is needed about the pathophysiology and its consequences for liver functions.
Various in vitro models have been developed for research on the liver to complement in vivo studies. Isolated and cultured primary hepatocytes from rodents and humans are widely used. Non-parenchymal cells can be separated from hepatocytes using differential and gradient centrifugation, and the co-culture of different cell types is useful for studying intercellular crosstalk1. Although primary human hepatocytes are considered the golden standard for testing drug toxicity, several studies have shown that the hepatocytes rapidly dedifferentiate in tissue culture resulting in loss of hepatic functions2,3,4. Hepatocyte culture in a 3D spheroid system ameliorates the dedifferentiation, is more stable, and appears to mimic the liver in vivo to a higher degree than the traditional 2D culture systems5. Precision-cut liver slices are another well-established in vitro model that keeps the tissue architecture intact and contains the non-parenchymal cells present in the liver6. More advanced in vitro models include liver-on-a-chip7 and liver organoids8. However, with all these approaches, there is a loss of structural integrity and flow dynamics, including vectorial portal-hepatic vein flow, which likely impacts the generalizability.
The isolated perfused rat liver was first described by Claude Bernard in 18559, and is still used in various scientific fields for studies of liver biology, toxicology, and pathophysiology. Advantages of the perfused liver compared to the above-mentioned in vitro models include the maintenance of the hepatic architecture, the vascular flow, the hepatocyte polarity and zonation, and the interactions between hepatocytes and non-parenchymal cells. Compared to in vivo studies, the perfused liver allows the study of liver metabolism in an isolated manner avoiding extra-hepatic factors carried by the blood and with complete control over the experimental conditions. Several modifications have been made to improve the rat liver perfusion model over the years10,11,12,13. Although mice have been used for isolated perfused liver studies, less literature is available. Here, we present a method for in situ perfusion of the mouse liver by cannulation of the portal vein and the suprahepatic vena cava inferior to study the acute and direct metabolic responses to metabolic substrates and hormones as measured in the hepatic venous effluent from the mouse liver in real-time.

저자 스포트라이트: 간 질환의 간 적응 및 당뇨병 전 단계 진행 조사 

간 포도당 생산, 요소 형성 및 지방 분해는 관류 마우스 간 모델을 사용하여 정량화되었습니다.

In our lab, we investigate how the liver responds to common, as well as rare liver diseases, and how these adaptation may predispose to a pre-diabetogenic state. The liver responds to changes in nutrient availability and concentrations of hormones with increased transcription of relevant genes, but importantly also, with acute and non-transcriptional regulation. With the perfused liver, we can quantify all aspects of metabolism, including the release of metabolites in a minute to minute resolution.Advantages of this technique compared to other in vitro models are that the liver is left in situ with an intact hepatic architecture. And that the liver is viable for at least three hours, allowing each mouse liver to be its own control. Lastly, increasing the translational relevance.Using the mouse perfused liver system, we are able to identify and characterize novel signaling cascade of the hormone glucagon. This may be important as glucagon, as well as other hormone, may play a vital role in the dysmetabolic conditions of the liver in patients with fatty liver disease and diabetes.

자극 또는 기질이 관심 분자의 방출로 이어지는지 여부를 결정하기 위해서는 꾸준한 기준선이 필요합니다. 그림 3A 는 성공적인 실험의 예를 보여줍니다. 관류된 간에서 요소의 생성은 2분 간격으로 측정되며 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 두 자극 기간 각각에 앞서는 기준선 기간은 일정합니다. 두 자극 기간 동안의 평균 요소 생산량과 각각의 이전 기?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases at JoVE.com

여기에서, 우리는 간 구조를 방해하지 않으면서 간 외 요인이 없는 상태에서 간 대사의 급성 및 직접적인 조절을 연구하기 위해 쥐 간의 현장 관류를 위한 강력한 방법을 제시합니다.

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

우리 연구실에서는 간이 일반 간 질환과 희귀 간 질환에 어떻게 반응하는지, 그리고 이러한 적응이 어떻게 당뇨병 전 단계에 걸리기 쉬운지 조사합니다. 간은 관련 유전자의 전사를 증가시켜 영양소 가용성과 호르몬 농도의 변화에 반응하지만, 중요한 것은 급성 및 비전사 조절에도 반응합니다. 관류된 간을 사용하면 대사 산물의 방출을 포함하여 신진대사의 모든 측면을 분 단위로 정량화할 수 있습니다.다른 시험관 모델과 비교했을 때 이 기술의 장점은 간이 온전한 간 구조로 제자리에 남아 있다는 것입니다. 그리고 간은 적어도 3시간 동안 생존할 수 있으며, 각 쥐의 간이 스스로 통제할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 번역 관련성을 높입니다.쥐의 관류 간 시스템을 사용하여 호르몬 글루카곤의 새로운 신호 전달 캐스케이드를 식별하고 특성화할 수 있습니다. 이는 글루카곤과 다른 호르몬이 지방간 질환 및 당뇨병 환자의 간 대사 장애에 중요한 역할을 할 수 있기 때문에 중요할 수 있습니다.

간 포도당 생산, 요소 형성 및 지방 분해는 관류 마우스 간 모델을 사용하여 정량화되었습니다.

Abstract