Профилирование бактериального сообщества ферментируемого винограда сорта Traminette во время производства вина с использованием метагеномного ампликонного секвенирования

Summary

Здесь мы представляем протокол для описания метагеномики ампликона для определения бактериального сообщества винограда сорта Траминет, бродящего винограда и конечного вина.

Abstract

Достижения в технологии секвенирования и относительно легкий доступ к использованию инструментов биоинформатики для профилирования структур микробных сообществ способствовали лучшему пониманию как культивируемых, так и некультивируемых микробов в винограде и вине. Во время промышленной ферментации микробы, известные и неизвестные, часто ответственны за развитие продукта и неприятный привкус. Таким образом, профилирование бактерий от винограда до вина может позволить легко понять микробную динамику in situ . В этом исследовании бактерии винограда сорта Траминетт должны подвергаться ферментации, а конечное вино подвергалось экстракции ДНК, которая давала от 15 нг/мкл до 87 нг/мкл. Был секвенирован ампликон 16S гипервариабельной области области V4, относительно распространенных бактерий, состоящих из типов Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota, за которыми следуют Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota и Acidobacteriota. Анализ диаграммы Венна общих уникальных таксономических единиц (OTU) показал, что 15 типов бактерий были общими как для виноградного сусла, так и для стадии брожения и конечного вина. С помощью секвенирования ампликонов 16S были обнаружены такие типы, о которых ранее не сообщалось, а также такие роды, как Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae. Исследованы различия в использовании органических питательных веществ в вине и их влияние на бактерии; Резервуар Traminette R , содержащий Fermaid O и Traminette L , стимулированный Stimula Sauvignon Blanc + Fermaid O. Альфа-разнообразие с помощью критерия Краскела-Уоллиса определяло степень равномерности. Бета-разнообразие указывало на сдвиг бактерий на стадии брожения для двух обработок, и окончательные винные бактерии выглядели одинаково. Исследование подтвердило, что секвенирование ампликонов 16S может быть использовано для мониторинга изменений бактерий во время производства вина для поддержания качества и лучшего использования виноградных бактерий во время производства вина.

Introduction

Виноград сорта Траминетт характеризуется производством вина превосходного качества, а также заметной урожайностью и частичной устойчивостью к нескольким грибковым инфекциям ^1,2,3. Естественное брожение винограда зависит от связанных с ним микроорганизмов, среды производства вина и бродильных сосудов ^4,5. Часто многие винодельни полагаются на дикие дрожжи и бактерии для брожения, производства спирта, сложных эфиров^{, развития} аромата и вкуса.

Целью данного исследования....

Protocol

1. Экспериментальное производство вина

1. Получите виноград Traminnette из вина Dynamis Estate в Джонсвилле, Северная Каролина, очистите от гребней и измельчите, чтобы выпустить сусло в два отдельных ферментера с открытым верхом объемом 600 л и оставить на кожице примерно на 4 дня с закрыт.......

Discussion

Протокол метагеномики начинается с отбора проб виноградного сусла, а при добавлении в сусло дрожжей - бродящего вина и окончательных образцов вина. За этим последовало выделение дубликатов ДНК, которое было успешно извлечено из этих образцов. Полученные количества варьировали в конце?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation