Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

Abstract

Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.

Introduction

Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.

חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על....

Protocol

אנטרואידים נגזרו מדגימות מעיים קטנות מפגים (שנולדו בשבוע 22 עד 36 להריון) שהתקבלו בזמן הניתוח ל- NEC או למחלות מעיים אחרות עם אטיולוגיות לא דלקתיות. כל איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו לאחר הסכמה מדעת ואישור מוועדות הביקורת המוסדיות באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (מספרי פרוטוקול IRB 201706182 ו-201804040).......

Representative Results

אנטרואידים נזרעו על המכשיר המיקרופלואידי (איור 1) וגודלו בתרבית כפי שתואר לעיל. גדילת האנטרואידים במטריצת הידרוג'ל של תרבית תאים לפני הזריעה, ולאחר מכן ההתרחבות של חד-שכבה של תאי אפיתל המעי לאחר הזריעה, נוטרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2). חד-שכבה חד-שכב.......

Discussion

מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תל?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים הקשורים לכתב יד זה.

Acknowledgements

כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate ReaderAgilent 7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-MicroBrandTech759085D
Cell Recovery SolutionCorning354270
CFX Opus Real-Time PCR SystemsBio-Rad12011319
Chip CradleEmulateN/A
Chip-S1 Stretchable ChipEmulateN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well Corning3548
Collagen from human placentaSigma-AldrichC5533
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit Cell BiologicsH-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mLFisher Scientific05-539-8
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogen C10283
Countess II automated cell counterInvitrogen AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine FixableInvitrogen D7132Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membraneFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucoseSigma-AldrichD5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 surface activation reagentEmulateER-1Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent EmulateER-2Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mmFisher ScientificFB0875713
Gelatin-Based Coating Solution Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
Gentamicin Gibco15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate InvitrogenH3570
Human Collagen Type ISigma-AldrichCC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial CellsCell BiologicsH-6054
Inverted MicroscopeFisher Scientific03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water BathsFisher ScientificFSGPD10
L-Glutamine Gibco25030-081
Luria Broth (LB) agar, MillerSupelcoL3027
L-WRN Cells American Type Culture CollectionCRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific840-274200
NicotinamideSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 Hub ModuleEmulateN/A
ParaformaldehydeThermoFisher047392.9L
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8Rainin17014966
Pod Portable ModuleEmulateN/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit QIAGEN205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated Corning431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter UnitMilliporeSE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70umFisher Scientific22-363-548
Sterile Syringes, 10mLFisher Scientific14-955-453
Straight, fine, sharp point scissorsMiltex InstrumentsMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD CentrifugeThermo Scientific75016052
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787Detergent
TRIzol Reagent Invitrogen15596026RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Gibco12604013Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 Culture ModuleEmulateN/A

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NEC on a chip

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved