A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.
Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.
Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.
חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על....
אנטרואידים נגזרו מדגימות מעיים קטנות מפגים (שנולדו בשבוע 22 עד 36 להריון) שהתקבלו בזמן הניתוח ל- NEC או למחלות מעיים אחרות עם אטיולוגיות לא דלקתיות. כל איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו לאחר הסכמה מדעת ואישור מוועדות הביקורת המוסדיות באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (מספרי פרוטוקול IRB 201706182 ו-201804040).......
אנטרואידים נזרעו על המכשיר המיקרופלואידי (איור 1) וגודלו בתרבית כפי שתואר לעיל. גדילת האנטרואידים במטריצת הידרוג'ל של תרבית תאים לפני הזריעה, ולאחר מכן ההתרחבות של חד-שכבה של תאי אפיתל המעי לאחר הזריעה, נוטרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2). חד-שכבה חד-שכב.......
מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תל?.......
כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
Chip Cradle | Emulate | N/A | |
Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
SB 431542 | Tocris | 1614 | |
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | |
Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved