Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Abstract

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia intestinale grave e potenzialmente fatale che è stata difficile da studiare a causa della sua complessa patogenesi, che rimane incompletamente compresa. La fisiopatologia della NEC comprende l'interruzione delle giunzioni strette intestinali, l'aumento della permeabilità della barriera intestinale, la morte delle cellule epiteliali, la disbiosi microbica e l'infiammazione disregolata. Gli strumenti tradizionali per studiare la NEC includono modelli animali, linee cellulari e organoidi intestinali umani o murini. Mentre gli studi che utilizzano questi sistemi modello hanno migliorato la comprensione del campo della fisiopatologia della malattia, la loro capacità di ricapitolare la complessità della NEC umana è limitata. È stato ora sviluppato un modello in vitro migliorato di NEC che utilizza la tecnologia microfluidica, denominato NEC-on-a-chip. Il modello NEC-on-a-chip consiste in un dispositivo microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati da un neonato pretermine, co-coltivato con cellule endoteliali umane e il microbioma di un neonato con NEC grave. Questo modello è uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici sulla fisiopatologia della NEC e una nuova risorsa per i test di scoperta di farmaci per le malattie intestinali neonatali. In questo manoscritto, verrà fornita una descrizione dettagliata del modello NEC-on-a-chip.

Introduzione

L'enterocolite necrotizzante (NEC) colpisce i neonati pretermine, con un'incidenza fino al 10% in quelli nati di peso < 1500 g¹. La fisiopatologia della NEC è complessa e comprende danni all'epitelio intestinale, interruzione delle giunzioni strette intestinali, aumento della permeabilità della barriera intestinale, disregolazione immunitaria e morte delle cellule epiteliali ^2,3. La nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nella patogenesi della NEC rimane incompleta e, nonostante decenni di ricerca, non esistono ancora terapie mirate efficaci.

Un ostacolo significativo all'avanzamento della ricerca NEC è la limitata disponibilità e le piccole dimensioni del tessuto intestinale primario isolato da neonati umani. Il tessuto intestinale resecato dai neonati con NEC è spesso necrotico e gravemente danneggiato, il che complica gli studi sui meccanismi che precedono l'insorgenza della malattia. Ad esempio, l'intestino tenue dei neonati con NEC è inondato di cellule immunitarie e si osservano anche un numero ridotto di cellule staminali intestinali, una diminuzione della proliferazione delle cellule epiteliali e un aumento dell'apoptosi delle cellule epiteliali 4,5,6,7. Ciò comporta difficoltà nella coltura di cellule epiteliali intestinali da questi campioni e nell'isolamento di RNA e proteine, che possono essere degradate in questo ambiente infiammatorio ostile. Inoltre, poiché il processo della malattia è già avanzato nei neonati con NEC chirurgica, gli studi meccanicistici sui fattori che inducono la malattia non sono fattibili. Queste limitazioni hanno portato a fare affidamento su modelli animali per gli studi meccanicistici della NEC.

Sono stati stabiliti modelli animali di NEC per topi, ratti, suinetti, conigli e babbuini 5,8,9,11. Un punto di forza dei modelli animali è che la malattia intestinale simile alla NEC è indotta da fattori associati all'insorgenza della NEC nell'uomo, tra cui un microbioma disbiotico, ripetuti episodi di ipossia e l'assenza di poppate da latte materno 5,8,10,11. Inoltre, la risposta infiammatoria e i cambiamenti patologici osservati durante la NEC sperimentale sono paralleli alla malattia umana ^5,9,12. Mentre questi modelli imitano molte delle caratteristiche della NEC umana, ci sono differenze intrinseche tra la fisiopatologia della NEC negli animali e nell'uomo. Ad esempio, il modello murino di NEC è indotto in topi nati a termine e, sebbene il loro sviluppo intestinale sia incompleto, la fisiopatologia di NEC è intrinsecamente diversa in questo contesto clinico. L'espressione genica intestinale murina alla nascita è simile a quella di un feto umano pre-vitale e non si avvicina a quella di un neonato pretermine di 22-24 settimane di gestazione fino al giorno 14 (P14)¹³. Questo confonde il modello murino di NEC perché il danno intestinale non può generalmente essere indotto nei topi dopo P10. Inoltre, i ceppi consanguinei di topi mancano della diversità immunologica¹⁴ e microbiologica dei neonati umani¹⁵, che funge da altro fattore confondente. Pertanto, una maggiore incorporazione di campioni umani primari nella ricerca NEC migliora la rilevanza clinica degli studi in questo campo.

Gli studi sui meccanismi del NEC in vitro hanno tradizionalmente utilizzato linee cellulari monotipiche derivate da cellule tumorali intestinali adulte, come le cellule di adenocarcinoma colorettale (Caco2) e adenocarcinoma del colon umano (HT-29)¹⁶. Questi modelli sono convenienti ma limitati nella rilevanza fisiologica a causa della loro crescita da cellule tumorali adulte, dell'architettura non polarizzata e dei cambiamenti fenotipici legati a passaggi ripetuti in coltura. Gli enteroidi intestinali migliorano questi modelli poiché possono essere cresciuti dalle cripte del tessuto intestinale, differenziati in tutti i sottotipi epiteliali intestinali e formare una struttura tridimensionale (3D) simile a villi^17,18,19,20. Recentemente, gli enteroidi intestinali sono stati combinati con la tecnologia microfluidica per sviluppare un modello di intestino tenue su chip e fornire un sistema modello in vitro fisiologicamente più rilevante²¹.

I primi dispositivi microfluidici organ-on-a-chip sono stati introdotti nei primi anni 2000^22,23,24. Il primo modello organ-on-a-chip è stato il respiratore umano lung-on-a-chip²⁵. Questo è stato seguito da numerosi modelli monoorgano come l'intestino²¹, il fegato²⁶, i reni²⁷, il midollo osseo 28, la barriera emato-encefalica²⁹ e il cuore³⁰. Questi modelli organ-on-a-chip sono stati utilizzati per studiare malattie acute, croniche e rare, tra cui la sindrome acuta da ^{radiazioni,31} la broncopneumopatia cronica ostruttiva32 e le malattie neurodegenerative33. La natura polarizzata delle cellule su questi chip e la presenza di due compartimenti cellulari separati da una membrana porosa consente la modellazione di processi fisiologici complessi come la perfusione, i gradienti di concentrazione chimica e la chemiotassi delle cellule immunitarie^34,35. Questi sistemi microfluidici forniscono quindi un nuovo strumento per studiare la fisiopatologia e i meccanismi delle malattie umane.

Il modello di intestino tenue su chip è stato descritto da Kasendra et al. nel 2018, che hanno utilizzato campioni di biopsia intestinale tenue pediatrici (di età compresa tra 10 e 14 anni) differenziati in enteroidi e coltivati su un dispositivo microfluidico²¹. In questo modello sono state incorporate anche le cellule endoteliali vascolari, il flusso continuo dei terreni e l'allungamento/rilassamento. Hanno osservato la differenziazione del sottotipo epiteliale intestinale, la formazione di assi simili a villi 3D, la produzione di muco e i modelli di espressione genica dell'intestino tenue²¹. Questo modello microfluidico è stato applicato alle malattie neonatali con lo sviluppo del sistema NEC-on-a-chip, che incorpora enteroidi intestinali neonatali, cellule endoteliali e il microbioma di un neonato con NEC³⁶. NEC-on-a-chip ricapitola molte delle caratteristiche critiche del NEC umano, tra cui l'espressione genica infiammatoria, la perdita di cellule epiteliali specializzate e la ridotta funzione di barriera intestinale³⁶. Pertanto, questo modello ha numerose applicazioni nello studio della NEC, compresi gli studi meccanicistici e la scoperta di farmaci. In questo manoscritto, viene fornito un protocollo dettagliato per le prestazioni del modello NEC-on-a-chip.

Protocollo

Gli enteroidi sono stati derivati da campioni di intestino tenue di neonati prematuri (nati a 22-36 settimane di gestazione) ottenuti al momento dell'intervento chirurgico per NEC o altre condizioni intestinali con eziologie non infiammatorie. Tutta la raccolta e l'elaborazione dei campioni sono state eseguite dopo il consenso informato e l'approvazione da parte degli Institutional Review Boards della Washington University di St. Louis (numeri di protocollo IRB 201706182 e 201804040) e dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (numero di protocollo IRB 21-3134).

1. Isolamento e placcatura di cripte dall'intestino tenue neonatale umano per stabilire enteroidi

1. Preparazione dei supporti
   1. Preparare tutti i supporti necessari come descritto nella Tabella 1. Assicurarsi che venga utilizzata una tecnica asettica per la preparazione di tutti i terreni. Filtrare: sterilizzare i terreni con un filtro da 0,2 μm e conservare a 4 °C fino all'uso.
2. Lavaggio e triturazione del tessuto intestinale
   1. Posizionare l'idrogel della matrice di coltura cellulare su ghiaccio per scongelare. Prelevare tessuto intestinale umano dalla sala operatoria. Posizionare immediatamente il campione in 5 ml di terreno di lavaggio dei tessuti ghiacciato per inattivare le proteasi endogene.
   2. Sciacquare il contenuto intestinale con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ghiacciata (D-PBS) utilizzando una siringa da 10 ml dotata di puntale per pipetta P1000 tagliato. Trasferire il tessuto intestinale in una capsula da 35 mm contenente 5 ml di D-PBS ghiacciato.
   3. Tagliare il tessuto intestinale longitudinalmente per esporre il lume e tagliarlo a pezzetti usando forbici sottili. Sciacquare il tessuto intestinale agitando delicatamente il D-PBS nel piatto di coltura tissutale.
   4. Trasferire i frammenti di tessuto in un piatto pulito da 35 mm. Tritare il tessuto con le forbici fini. La dimensione ottimale è di 0,5 cm² per pezzo. Il tessuto intestinale deve passare attraverso un puntale di pipetta da 1 mL tagliato.
3. Dissociazione del tessuto intestinale
   1. Aggiungere 1 mL di collagenasi I preriscaldata al tessuto. Miscelare il tessuto con la collagenasi pipettando 10-15 volte e trasferire in una provetta conica da 15 ml.
   2. Fissare il tubo orizzontalmente su uno shaker impostato a 50 giri/min. Agitare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Dopo l'incubazione, rimuovere le provette dall'agitatore e risospendere la soluzione pipettando 10-15 volte. Opzionale: rimuovere una piccola aliquota per verificare la presenza di singole cripte utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
4. Isolamento delle cripte intestinali
   1. Filtrare le cripte attraverso un colino da 70 μm in una provetta conica da 50 mL su ghiaccio. Lavare il colino con 9 ml di materiale di lavaggio dei tessuti ghiacciato. Trasferire il filtrato in una provetta conica da 15 mL.
   2. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere delicatamente il surnatante. Ci saranno circa 200 μL di fluido rimanenti nella provetta. Risospendere il pellet in 5 mL di terreno di lavaggio dei tessuti ghiacciato.
   3. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno di lavaggio dei tessuti e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
   4. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cripte. Aspirare il surnatante con cura e completamente, il più possibile, utilizzando una pipetta. Metti il tubo sul ghiaccio.
5. Placcare le cripte intestinali
   1. Risospendere il pellet nell'idrogel della matrice di coltura cellulare (20 μL/pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti) utilizzando una punta di pipetta pre-raffreddata per creare una sospensione omogenea di cripte mentre la provetta rimane sul ghiaccio. Evitare di fare bolle durante il pipettaggio. Tenere il tubo sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
      NOTA: L'idrogel della matrice di coltura cellulare polimerizza a temperature superiori a 8 °C. Le cripte isolate da un pezzo di tessuto intestinale di 0,5 cm-1 cm di lunghezza sono generalmente piastrate in 10 pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti.
   2. Placcare la sospensione di idrogel della matrice di coltura cellulare/cripta in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti preriscaldata. Riscaldare la piastra per favorire la solidificazione della matrice. Posizionare la sospensione al centro del pozzetto. Evitare le bolle durante la placcatura.
   3. Incubare le piastre per 20 minuti a 37 °C per polimerizzare la matrice. È essenziale che l'idrogel della matrice di coltura cellulare polimerizzi completamente prima di aggiungere il terreno.
   4. Dopo la polimerizzazione della matrice, aggiungere 300 μL di terreno condizionato con L-WRN al 50% preriscaldato a ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.
   5. Cambiare supporto ogni 2 o 3 giorni. Sostituire con un terreno caldo condizionato al 50% di L-WRN. Passaggio ogni 7-10 giorni. Enteroidi di passaggio quando sono confluenti al 50%-90% e mostrano la formazione di gemme.
      NOTA: Potrebbe essere necessario sostituire il supporto più frequentemente se diventa giallo. La frequenza di passaggio dipenderà dalla densità enteroide e dal tasso di crescita delle cellule di un particolare paziente. Gli enteroidi dovranno essere attraversati se i loro centri diventano scuri in apparenza.
6. Far passare gli enteroidi
   1. Aspirare delicatamente i fluidi dai pozzetti. Lavare accuratamente i pozzetti con 500 μL di D-PBS caldo. Fare attenzione a non disturbare la matrice.
   2. Aggiungere 250 μL di soluzione di recupero della cella fredda a ciascun pozzetto. Grattare il fondo di ciascun pozzetto con un puntale di pipetta nuovo per interrompere l'idrogel della matrice di coltura cellulare. Incubare la piastra su ghiaccio per 30 min.
   3. Dissociare gli enteroidi mediante pipettaggio vigoroso (~25-50 volte con la pipetta P200) e aggiungere 500 μL di terreno di lavaggio dei tessuti.
   4. Trasferire la sospensione enteroide in una provetta da 15 mL e aggiungere altri 5 mL di terreno di lavaggio dei tessuti freddi. Pipettare delicatamente per formare una soluzione omogenea.
   5. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare gli enteroidi. Posizionare la provetta sul ghiaccio e aspirare il surnatante nel modo più completo possibile. Ci saranno circa 30-60 μL rimanenti nella provetta.
      NOTA: In caso di difficoltà a rompere gli enteroidi con il pipettaggio, è possibile utilizzare il reagente di tripsina-EDTA allo 0,25% o di dissociazione enzimatica per facilitare questo processo.
   6. Risospendere gli enteroidi nel volume residuo del terreno di lavaggio con una pipetta P200. Evitare la formazione di bolle durante il pipettaggio.
   7. Aggiungere 20 μL di idrogel di matrice di coltura cellulare per ogni nuovo pozzetto di una piastra a 48 pozzetti alla sospensione enteroide. Dividi gli enteroidi 1:3, 1:4 o 1:5, a seconda della loro densità.
   8. Aggiungere la sospensione a una piastra preriscaldata a 48 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti per solidificare la matrice.
   9. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 300 μL di terreno condizionato con L-WRN preriscaldato al 50% a ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.

2. Modello intestinale neonatale su chip

NOTA: Per istruzioni dettagliate sulla manipolazione dei chip microfluidici e sull'utilizzo di questa apparecchiatura, consultare il protocollo di coltura duodeno-chip^{intestinale 37} del produttore.

1. Preparazione dei supporti
   1. Preparare tutti i supporti necessari come descritto nella Tabella 2. Assicurarsi che venga utilizzata una tecnica asettica. Filtrare: sterilizzare i terreni con un filtro da 0,2 μm e conservare a 4 °C fino all'uso.
2. Giorno (-3): Scongelamento ed espansione delle cellule endoteliali microvascolari intestinali umane (HIMEC)
   1. Scongelare un flaconcino di HIMEC e una piastra secondo le raccomandazioni del produttore.
   2. Rivestire un pallone^{da 25} cm 2 con una soluzione di rivestimento a base di gelatina per 2 min. Rimuovere la soluzione in eccesso. Aggiungere nel matraccio gli HIMEC (circa 0,5-1 x 10⁶ cellule) risospesi in 6 mL di terreno HIMEC. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.
   3. Cambiare il supporto HIMEC ogni 48 ore. Aggiungere HIMEC al canale endoteliale (inferiore) del chip entro 48-72 ore dal momento in cui diventa confluente al 100%.
3. Giorno (-1): Attivazione e rivestimento dei chip prima dell'aggiunta degli enteroidi
   1. Ricostituire la polvere del reagente di attivazione del chip 1 (CR-1) per produrre una soluzione CR-1. Assicurarsi che la polvere CR-1 e la soluzione di reagente di attivazione del chip 2 (CR-2) siano a temperatura ambiente per questa fase.
      NOTA: Tenere sempre al riparo dalla luce la polvere CR-1 e la soluzione CR-1 preparata nei passaggi seguenti. La luce dovrebbe essere spenta nel cofano per questi passaggi.
      1. Posizionare il chip e il supporto per chip nella culla del chip, quindi posizionarli in una piastra di coltura tissutale nella cappa per colture cellulari. Consultare il protocollo del produttore per la tecnica corretta per il posizionamento dei trucioli nel supporto³⁷.
      2. Aggiungere 1 mL di soluzione di CR-2 al flaconcino di polvere di CR-1 e quindi trasferire direttamente la soluzione dal flaconcino di polvere di CR-1 a un tubo da 15 ml avvolto in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Non miscelare la soluzione con la pipetta. L'obiettivo è evitare la formazione di bolle.
      3. Aggiungere un altro 1 mL di soluzione di CR-2 al flaconcino di CR-1 e trasferire nella provetta da 15 mL. Ripetere per un totale di 4 risciacqui e un totale di 4 mL di CR-2 risciacquati attraverso il flaconcino di CR-1. Aggiungere il tappo al flaconcino e capovolgere per l'ultimo risciacquo per rimuovere eventuali residui di polvere.
      4. Aggiungere altri 6 mL di CR-2 alla provetta da 15 mL contenente CR-1 per un volume finale di 10 mL (0,5 mg/mL). Miscelare questa soluzione con una pipetta senza introdurre bolle. Assicurarsi che CR-1 sia completamente dissolto prima di procedere al passaggio successivo.
   2. Aggiunta della soluzione CR-1 al chip
      NOTA: È fondamentale evitare di introdurre bolle nei canali durante l'aggiunta di queste soluzioni. La soluzione CR-1 deve rimanere protetta dalla luce per questa fase.
      1. Utilizzando un puntale per pipette da 200 μL, aggiungere 20 μL di soluzione CR-1 all'ingresso del canale inferiore fino a quando la soluzione inizia a uscire dall'uscita del canale inferiore. Aggiungere 50 μL di soluzione CR-1 attraverso l'ingresso del canale superiore fino a quando la soluzione inizia a uscire dall'uscita del canale superiore. Rimuovere l'eventuale soluzione CR-1 in eccesso dalla superficie del truciolo mediante un'aspirazione delicata.
         NOTA: Le soluzioni devono sempre essere aggiunte al canale inferiore prima del canale superiore. Se si notano bolle, sciacquare entrambi i canali con la soluzione CR-1 e ripetere il punto 2.3.2.1.
      2. Se il coperchio della piastra di coltura tissutale contenente i trucioli è in posizione, rimuoverlo per questo passaggio. Mettere le patatine sotto la luce UV per 15 min. Rimuovere CR-1 dai canali superiore e inferiore.
      3. Ripetere i passaggi da 2.3.2.1 a 2.3.2.2 per un totale di due passaggi di attivazione UV. Dopo questo passaggio, i chip non sono più sensibili alla luce.
      4. Rimuovere CR-1 dai canali superiore e inferiore. Lavare entrambi i canali con 100 μL di soluzione CR-2. Rimuovere la soluzione CR-2 dai canali superiore e inferiore.
      5. Lavare entrambi i canali con 100 μL di D-PBS sterile. Ripetere i lavaggi 2 volte. Aggiungere 100 μL di D-PBS a entrambi i canali. Rimuovere l'eccesso dalla superficie dei trucioli ma lasciare i canali pieni.
   3. Rivestire i canali con la matrice extracellulare.
      1. Scongelare la fibronectina, il collagene IV e l'idrogel della matrice di coltura cellulare sul ghiaccio immediatamente prima di questo passaggio e mantenere queste soluzioni sul ghiaccio per il resto di questa sezione.
      2. Preparare le seguenti soluzioni di matrice extracellulare (ECM) per i canali superiore e inferiore del chip:
         Canale superiore: 100 μL di 200 μg/mL di collagene di tipo IV e 100 μg/mL di idrogel di matrice di coltura cellulare in D-PBS per chip.
         Canale inferiore: 100 μL di 200 μg/mL di collagene di tipo IV e 30 μg/mL di fibronectina in D-PBS per chip.
      3. Rimuovere completamente il D-PBS dai canali superiore e inferiore. Aggiungere 50 μL di ECM all'ingresso del canale inferiore fino a quando non appare una goccia sull'uscita. Ripetere l'operazione per il canale superiore. Assicurarsi di utilizzare le soluzioni ECM appropriate per ciascun canale e aggiungere prima la soluzione al canale inferiore.
      4. Aggiungere D-PBS al serbatoio della culla del truciolo e riposizionare il coperchio sulla piastra di coltura tissutale. Porre i trucioli in un'incubatrice umidificata a 37 °C, 5% di CO₂ per una notte.
4. Giorno (0): Semina di chip con HIMEC ed enteroidi
   1. Equilibratura sottovuoto dei fluidi
      1. Per completare l'esperimento, aggiungere il volume richiesto di terreno HIMEC e di terreno di espansione del chip a una provetta conica sterile da 50 mL. Equilibrare il terreno a 37 °C a bagnomaria per almeno 1 ora.
      2. Collegare il dispositivo di filtrazione sottovuoto a provette da 50 mL contenenti fluidi riscaldati. Le provette devono essere orientate con il terreno preriscaldato sul fondo della provetta conica da 50 mL. Vuoto a -70 kPa o superiore per 10 s.
      3. Capovolgere i tubi in modo che il materiale si muova attraverso il filtro. Continuare ad aspirare per 5 min. Al termine della filtrazione sottovuoto, rimuovere il dispositivo di filtrazione sottovuoto e posizionare le provette da 50 mL contenenti il terreno nell'incubatore a 37 °C.
   2. Lavare le patatine
      1. Lavare il canale endoteliale lavando con 100 μL di terreno HIMEC preriscaldato.
         Lavare il canale epiteliale lavando con 100 μL di terreno di espansione del chip preriscaldato. Rimuovere eventuali supporti che si sono diffusi sulla superficie dei trucioli.
      2. Ripetere la fase di lavaggio. I fluidi devono rimanere nei canali e nelle porte di ingresso e uscita dopo questi lavaggi. Riposizionare il coperchio della capsula contenente i trucioli e rimetterli nell'incubatrice fino al momento dell'uso.
   3. Raccolta degli HIMEC
      1. Aspirare i terreni dal matraccio da 25 cm² contenente HIMEC. Lavare delicatamente il monostrato con D-PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% preriscaldato nel matraccio e risciacquare delicatamente sul monostrato.
      2. Incubare il matraccio a 37 °C per 2-5 min. Neutralizzare la tripsina con 10 mL di terreno HIMEC. Risospendere le cellule nel terreno e trasferirle in una provetta da 15 ml.
      3. Centrifugare a celle 150 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in 200 μL di terreno HIMEC.
      4. Rimuovere 10 μL di cellule e posizionare la provetta sul ghiaccio. Conta le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. La concentrazione desiderata di HIMEC è compresa tra 6 x 10^e 8 x 10⁶ cellule/mL.
   4. Semina di HIMEC sul chip
      1. Rimuovere il chip dall'incubatrice e portarlo nella cappa. Aspirare tutti i supporti che potrebbero essere fuoriusciti sulla superficie del chip.
      2. Lavare il canale epiteliale (superiore) del chip con 100 μL di terreno di espansione del chip preriscaldato. Lavare il canale endoteliale (inferiore) del chip con 100 μL di terreno HIMEC preriscaldato.
      3. Risospendere delicatamente gli HIMEC per ottenere una distribuzione omogenea. Rimuovere completamente il terreno dal canale endoteliale (inferiore). Aggiungere 10 μL di HIMEC (~36.000 cellule/chip) al canale endoteliale (inferiore).
         NOTA: Se è difficile riempire il canale HIMEC senza formazione di bolle quando si utilizzano 10 μL di HIMEC, aumentare il volume delle celle aggiunte. Dovrebbe essere lo stesso numero di celle per chip.
      4. Aggiungere ulteriori mezzi di crescita organoide al canale epiteliale (superiore) se non è pieno. Controllare la densità di semina degli HIMEC. Se non sono distribuiti uniformemente e non coprono l'80%-90% della superficie del truciolo, sciacquare il canale e ripetere la semina.
      5. Capovolgere il chip nell'apposito alloggiamento nella piastra di coltura cellulare. Aggiungere D-PBS al serbatoio nella culla del truciolo. Riposizionare il coperchio del piatto di coltura cellulare e posizionarlo nell'incubatrice.
      6. Lasciare il chip invertito a 37 °C per 2-3 ore per consentire agli HIMEC di attaccarsi alla membrana del chip. Al termine dell'incubazione, riportare il truciolo/supporto per trucioli in posizione verticale.
      7. Lavare delicatamente il canale endoteliale (inferiore) con 100 μL di terreno HIMEC caldo. Lascia i file multimediali nel canale. Lavare delicatamente il canale epiteliale (superiore) con 100 μL di terreno di crescita organoide. Lascia i file multimediali nel canale.
      8. Rimettere i trucioli nell'incubatore a 37 °C mentre si completano i passaggi successivi.
   5. Prelievo di enteroidi e semina su chip
      NOTA: I chip vengono seminati con enteroidi che sono stati divisi 10-14 giorni prima, sono confluenti al 50%-75% e al passaggio 7 e 20. Si prega di vedere la Figura 2 per la comparsa degli enteroidi il giorno 0. Il tempo necessario affinché gli enteroidi siano pronti per la semina dipenderà dal tasso di crescita delle cellule di un particolare paziente.
      1. Aspirare delicatamente i fluidi dai pozzetti. Lavare accuratamente i pozzetti contenenti idrogel di matrice di coltura cellulare con 500 μL di D-PBS caldo. Fare attenzione a non disturbare l'idrogel della matrice di coltura cellulare.
      2. Aggiungere 250 μL di soluzione di recupero della cella fredda a ciascun pozzetto. Grattare il fondo di ciascun pozzetto con un nuovo puntale di pipetta per interrompere l'idrogel della matrice di coltura cellulare. Aggiungere il contenuto dei pozzetti in una provetta fredda da 15 ml su ghiaccio.
      3. Incubare la provetta su ghiaccio per 45 minuti e capovolgere la provetta ogni 3-5 minuti. Durante questa fase, preparare il terreno di dissociazione degli enteroidi. Mettere questo terreno a bagnomaria a 37 °C quando mancano 10 minuti alla fase di incubazione.
      4. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare gli enteroidi. Rimuovere il surnatante.
      5. Aggiungere al pellet 2 mL di terreno di dissociazione enteroide per piastra raccolta e porre a bagnomaria a 37 °C per 60-120 s. Agitare delicatamente il tubo durante l'incubazione. Incubare abbastanza a lungo da ottenere enteroidi frammentati ma senza dissociazione in una singola sospensione cellulare.
      6. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di terreno di lavaggio dei tessuti freddi a ciascuna provetta da 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare gli enteroidi. Aspirare completamente il surnatante.
      7. Risospendere il pellet in 200 μL di mezzo di espansione del truciolo. Dissociare gli enteroidi mediante pipettaggio vigoroso (~25-50 volte con la pipetta P200).
      8. Combinare le cellule in una provetta sterile per microcentrifuga da 1,5 mL. Pipettare delicatamente per formare una soluzione omogenea. L'obiettivo è quello di seminare il chip con enteroidi frammentati in piccoli gruppi di 10-30 cellule.
      9. Rimuovere 10 μL di sospensione cellulare per il conteggio. Mettere la sospensione cellulare rimanente sul ghiaccio. Regolare il volume del mezzo di espansione del chip per ottenere una concentrazione di 6 x 10⁶ cellule/mL.
         NOTA: Potrebbe essere necessario centrifugare gli enteroidi e risospenderli in un volume di terreno più piccolo per ottenere la densità richiesta.
      10. Portare i chip microfluidici nella cappa e aspirare il terreno dal canale epiteliale (superiore) del chip. Caricare il canale superiore del chip con 30 μL di celle risospese (~180.000 celle/chip). Garantire una copertura completa e uniforme del canale epiteliale del chip per la formazione di un monostrato. Se ciò non viene raggiunto, sciacquare gli enteroidi attraverso il chip e riseminare.
          NOTA: In caso di difficoltà nel raggiungimento di una sospensione uniforme durante il caricamento di più chip, gli enteroidi possono essere separati in aliquote da 40 μL in singole provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Ciò ridurrà al minimo la variabilità del numero di enteroidi e delle dimensioni dei frammenti man mano che il caricamento procede.
      11. Rimettere i trucioli nell'apposito alloggiamento nella piastra di coltura cellulare (se sono stati rimossi). Aggiungere D-PBS al serbatoio nella culla del truciolo. Riposizionare il coperchio del piatto di coltura cellulare e posizionare i trucioli a 37 °C, 5% di CO₂ per una notte.
5. Giorno (1): Preparazione delle cialde e introduzione del flusso alle patatine
   1. Portare i trucioli nella cappa per coltura tissutale. Sciacquare delicatamente il canale epiteliale due volte con 100 μL di terreno di espansione del chip. Sciacquare delicatamente il canale endoteliale due volte con 100 μL di terreno HIMEC. Rimuovere il materiale in eccesso dalla superficie del truciolo.
   2. Adescare i baccelli e regolarli secondo il protocollo del produttore³⁷. Aggiungere 2 mL di terreno appropriato ai serbatoi di ingresso. Aggiungere 300 μL del fluido appropriato ai serbatoi di uscita. La portata sarà di 30 μL/h. L'allungamento non verrà ancora avviato.
6. Giorno (2): Monitoraggio dello sviluppo del monostrato e del cambiamento dei supporti
   1. Metti in pausa il modulo di coltura e porta i baccelli nella cappa.
   2. Ispeziona patatine e baccelli per verificare la presenza di bolle. Esaminare il monostrato epiteliale utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Acquisisci immagini in posizioni coerenti in tutto il chip per monitorare i progressi. Immagina i chip mentre rimangono nei pod.
   3. Rimuovere il materiale filtrante dai serbatoi di ingresso del canale superiore e sostituirlo con 2 mL di terreno di differenziazione del chip. Aggiungere 1 mL di terreno HIMEC al serbatoio di ingresso del canale inferiore. Lasciare una quantità sufficiente di fluidi nei serbatoi di ingresso per garantire che il fondo del serbatoio rimanga coperto da un sottile strato di fluidi.
   4. Riportare i baccelli nel modulo di coltura e riavviare il flusso a 30 μL/h.
7. Giorno (3): Monitoraggio dello sviluppo del monostrato, avvio dell'allungamento e aggiunta di supporti
   1. Ripetere i passaggi 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione del chip al serbatoio di ingresso del canale superiore e aggiungere 1 mL di terreno HIMEC al serbatoio di ingresso del canale inferiore.
      NOTA: Rimuovere i supporti dai serbatoi di uscita di entrambi i canali una volta che iniziano a raggiungere il 50-75% della capacità.
   2. Riportare i pod nel modulo culture. Riavviare il flusso a 30 μL/h e iniziare l'allungamento al 2% di deformazione e una frequenza di 0,2 Hz.
8. Giorno (4): Monitoraggio dello sviluppo del monostrato, aumento dell'allungamento e aggiunta di supporti
   1. Ripetere i passaggi 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione del chip al serbatoio di ingresso del canale superiore e aggiungere 1 mL di terreno HIMEC al serbatoio di ingresso del canale inferiore.
      NOTA: Rimuovere i supporti dai serbatoi di uscita di entrambi i canali una volta che iniziano a raggiungere il 50-75% della capacità.
   2. Riportare i pod nel modulo culture. Riavviare il flusso a 30 μL/h e aumentare l'allungamento al 10% di deformazione e una frequenza di 0,2 Hz.
9. Dal giorno (5) al giorno (7): Monitoraggio dello sviluppo del monostrato e aggiunta di supporti
   1. Ripetere i passaggi 2.6.1.1. e 2.6.1.2. Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione del chip al serbatoio di ingresso del canale superiore e aggiungere 1 mL di terreno HIMEC al serbatoio di ingresso del canale inferiore.
   2. Riportare i pod nel modulo culture e riavviare il flusso e l'estensione. Una volta visualizzati gli assi simili a villi, procedi al modello NEC-on-a-chip.

3. Modello NEC-on-a-chip

1. Coltura di batteri intestinali
   NOTA: Questa fase richiede una scorta congelata pretitolata di batteri enterici da un paziente con NEC che viene preparata prima dell'inizio di questo protocollo. Per questi esperimenti, è stato utilizzato un impasto di batteri enterici polimicrobici precedentemente descritto da un paziente con NEC chirurgico grave³⁸.
   1. Preparare una scorta di glicerolo al 50% di batteri enterici e conservare in congelatore a -80 °C fino al nuovo utilizzo.
   2. Scongelare un'aliquota dei batteri intestinali e inoculare 10 μL in 3 mL di terreno Luria-Bertani (LB). Incubare a 37 °C agitando a 150 giri/min per una notte.
   3. Lo stesso giorno, lavare delicatamente i canali con 100 μL di terreno differenziato senza antibiotici preriscaldato (canale superiore) o 100 μL di terreno HIMEC preriscaldato senza antibiotici (canale inferiore). Aspirare completamente il mezzo e ripetere il risciacquo per un totale di 3 lavaggi.
   4. Dopo aver aspirato il terzo lavaggio, riposizionare il supporto nei canali e lasciare in posizione.
   5. Sciacquare i serbatoi di ingresso del canale superiore e inferiore con D-PBS sterile e quindi riempire con 3 mL del terreno privo di antibiotici appropriato. Adescare i baccelli e regolarli come in 2.5.2.
   6. Riportare il chip nel modulo di coltura e riavviare l'allungamento e il flusso.
   7. La mattina seguente, prelevare 1 mL di coltura batterica durante la notte e inocularla in 25 mL di terreno LB fresco.
   8. Rimettere questa nuova coltura nell'agitatore a 37 °C fino a quando il diametro esterno₆₀₀ raggiunge 0,6 ± 0,02 misurati utilizzando una cuvetta da 1 cm. Diluire la coltura batterica a 7 x 10⁸ unità formanti colonie/mL in terreni di espansione del chip privi di antibiotici.
   9. Conservare un'aliquota di questa coltura per confermare la concentrazione dell'inoculo³⁹. Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione dei batteri a seconda della risposta dell'epitelio.
   10. Rimuovere il terreno dal canale epiteliale (superiore). Aggiungere 30 μL di coltura batterica diluita in un terreno di espansione del chip privo di antibiotici al canale superiore del chip. Prestare molta attenzione per evitare la contaminazione incrociata del canale HIMEC (endoteliale) con batteri. Rimuovere eventuali supporti in eccesso dalla superficie del chip.
   11. Lasciare che i chip rimangano in condizioni statiche per 30 minuti per facilitare l'aderenza batterica al lato apicale dell'epitelio neonatale. Dopo l'incubazione, lavare il canale superiore con 100 μL di terreno di espansione privo di antibiotici per rimuovere i batteri non attaccati. Riportare i trucioli al modulo di coltura e riavviare l'allungamento e il flusso.
   12. Ogni 24 ore, rimuovere i baccelli dal modulo di coltura e lavare lentamente 100 μL di terreno di espansione del chip privo di antibiotici attraverso il canale epiteliale. Ciò aiuterà a prevenire la proliferazione batterica.

4. Saggio di permeabilità intestinale

NOTA: Questa operazione può essere eseguita in qualsiasi fase del protocollo. Se avviato quando i trucioli vengono seminati, il test della permeabilità intestinale può essere utilizzato per valutare in serie la confluenza del monostrato. Se iniziato con l'aggiunta di batteri intestinali, questo test può essere utilizzato per determinare l'influenza dei batteri intestinali sull'integrità del monostrato epiteliale intestinale.

1. Rimuovere il materiale dal serbatoio di ingresso per il canale epiteliale (superiore). Aggiungere al serbatoio di ingresso un terreno appropriato contenente colorante di permeabilità (50 μg/mL). Utilizzare mezzi di differenziazione dei chip privi di antibiotici per il modello NEC-on-a-chip.
2. Raccogliere gli effluenti dai canali epiteliale ed endoteliale ogni 24 ore. Quantificare la concentrazione del colorante di permeabilità utilizzando un lettore per micropiastre come da Lanik et ^al.36.

5. Immunoistochimica

1. Lavare delicatamente il canale inferiore e il canale superiore del chip con 200 μL di D-PBS. Aspirare completamente il D-PBS dai canali.
2. Fissare le cellule lavando entrambi i canali con paraformaldeide al 4%, lasciando la soluzione nei canali. Aspirare l'eccesso dalla superficie del truciolo. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
3. Lavare entrambi i canali con 200 μL di D-PBS. Lasciare D-PBS nel canale inferiore e rimuoverlo completamente dal canale superiore.
4. Permeabilizzare lo strato epiteliale lavando il canale superiore con 100 μL di soluzione detergente allo 0,1%, lasciando la soluzione nei canali. Aspirare l'eccesso dalla superficie del truciolo e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
5. Lavare entrambi i canali con 200 μL di D-PBS. Lasciare D-PBS nel canale inferiore e rimuoverlo completamente dal canale superiore.
6. Aggiungere il 10% di siero d'asina (o un agente bloccante appropriato) nel canale superiore per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare entrambi i canali con 200 μL di D-PBS. Lasciare D-PBS nel canale inferiore e rimuoverlo completamente dal canale superiore.
7. Diluire gli anticorpi primari in siero d'asino al 5% e aggiungerli al canale superiore del chip (gli anticorpi e le concentrazioni precedentemente testati sono disponibili in Lanik et ^al.36). Incubare a 4 °C per una notte.
8. Lavare entrambi i canali 3 volte con 200 μL di D-PBS. Lasciare D-PBS nel canale inferiore e rimuoverlo completamente dal canale superiore.
9. Anticorpi secondari diluiti marcati con fluorescenza diluiti 1:200 in siero d'asina al 5% in D-PBS e Hoechst 33342 o DAPI (coloranti nucleari). Aggiungere anticorpi secondari al canale superiore del chip. Incubare a temperatura ambiente per 1 h, al riparo dalla luce.
10. Lavare entrambi i canali 3 volte con 200 μL di D-PBS. Lasciare i canali riempiti con D-PBS dopo il lavaggio finale. Posizionare il chip in una capsula di imaging con D-PBS per l'acquisizione di immagini mediante microscopia confocale.
    NOTA: I trucioli fissi, colorati o non colorati, possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana in PBS. Assicurarsi che i canali non si asciughino durante questo periodo.

6. Isolamento dell'RNA, preparazione del cDNA e PCR quantitativa in tempo reale

1. Lavare delicatamente il canale inferiore e il canale superiore del chip con 200 μL di D-PBS. Aspirare completamente il D-PBS dai canali.
2. Estrarre l'RNA totale dalle cellule utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore. Per isolare l'RNA solo dall'epitelio, infondere solo attraverso il canale superiore.
3. Quantificare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a nanovolumi. Trascrivere inversamente 1 μg di RNA totale. Esegui la PCR quantitativa in tempo reale. I primer precedentemente utilizzati in questo modello sono disponibili in Lanik et al. ³⁶.

Risultati

Gli enteroidi sono stati seminati sul dispositivo microfluidico (Figura 1) e coltivati come descritto sopra. La crescita degli enteroidi nell'idrogel della matrice di coltura cellulare prima della semina e quindi la successiva espansione del monostrato di cellule epiteliali intestinali dopo la semina del dispositivo sono state monitorate tramite microscopia in campo chiaro (Figura 2). Un monostrato di cellule epiteliali intestinali confluenti si è formato e suc...

Discussione

Questo sistema NEC-on-a-chip è un nuovo potente strumento che può essere utilizzato per modellare la fisiopatologia del NEC. Questa piattaforma fornisce un microambiente complesso che assomiglia più da vicino all'ambiente intestinale in vivo rispetto ai modelli precedenti, incorporando un sistema di co-coltura con flusso luminale continuo e allungamento. Queste condizioni promuovono lo sviluppo di un'architettura simile a un villo 3D rivestito da un epitelio altamente polarizzato costituito da sottotipi epite...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A