Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает in vitro модель некротизирующего энтероколита (НЭК), которая может быть использована для механистических исследований патогенеза заболевания. Он представляет собой микрофлюидный чип, засеянный кишечными энтероидами, полученными из кишечника новорожденного человека, эндотелиальными клетками и кишечным микробиомом новорожденного с тяжелой формой НЭК.

Abstract

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является тяжелым и потенциально смертельным заболеванием кишечника, которое трудно изучать из-за его сложного патогенеза, который остается до конца изученным. Патофизиология НЭК включает нарушение плотных соединений кишечника, повышенную проницаемость кишечного барьера, гибель эпителиальных клеток, микробный дисбиоз и нарушение регуляции воспаления. Традиционные инструменты для изучения НЭК включают животные модели, клеточные линии и органоиды кишечника человека или мыши. Несмотря на то, что исследования с использованием этих модельных систем улучшили понимание патофизиологии заболеваний, их способность повторить сложность НЭК человека ограничена. В настоящее время разработана улучшенная модель NEC in vitro с использованием микрофлюидной технологии, получившая название NEC-on-a-chip. Модель NEC-on-a-chip состоит из микрофлюидного устройства, засеянного кишечными энтероидами, полученными от недоношенного новорожденного, культивируемым совместно с эндотелиальными клетками человека и микробиомом младенца с тяжелой формой НЭК. Эта модель является ценным инструментом для механистических исследований патофизиологии НЭК и новым ресурсом для тестирования на открытие лекарств для лечения кишечных заболеваний новорожденных. В данной рукописи будет приведено подробное описание модели NEC-on-a-chip.

Introduction

Некротизирующий энтероколит (НЭК) поражает недоношенных новорожденных с частотой до 10% у рожденных с массой тела < 1500г1. Патофизиология НЭК является комплексной и включает повреждение кишечного эпителия, нарушение плотных соединений кишечника, повышение проницаемости кишечного барьера, иммунную дисрегуляцию и гибель эпителиальных клеток 2,3. Наше понимание механизмов, участвующих в патогенезе НЭК, остается неполным, и, несмотря на десятилетия исследований, до сих пор не существует эффективных таргетных методов лечения.

Существенным препятствием для продвиж....

Protocol

Энтероиды были получены из образцов тонкого кишечника недоношенных детей (родившихся на сроке от 22 до 36 недель беременности), полученных во время операции по поводу НЭК или других кишечных заболеваний невоспалительной этиологии. Весь сбор и обработка образцов осуществлялись после инф.......

Representative Results

Энтероиды высевали в микрофлюидное устройство (рис. 1) и культивировали, как описано выше. С помощью светлопольной микроскопии контролировали рост энтероидов в матриксном гидрогеле клеточной культуры до посева и последующее расширение монослоя клеток эпителия кишечни.......

Discussion

Эта система NEC-on-a-chip является новым мощным инструментом, который может быть использован для моделирования патофизиологии NEC. Эта платформа обеспечивает сложную микросреду, которая более близка к кишечной среде in vivo , чем предыдущие модели, за счет включения системы кокультивирован.......

Acknowledgements

Эта рукопись была поддержана R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) и R01HD105301 (MG) из Национальных институтов здравоохранения, грантом Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), премией Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), грантом UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) благодаря щедрой поддержке доноров Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, и кафедра педиатрии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate ReaderAgilent 7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-MicroBrandTech759085D
Cell Recovery SolutionCorning354270
CFX Opus Real-Time PCR SystemsBio-Rad12011319
Chip CradleEmulateN/A
Chip-S1 Stretchable ChipEmulateN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well Corning3548
Collagen from human placentaSigma-AldrichC5533
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit Cell BiologicsH-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mLFisher Scientific05-539-8
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogen C10283
Countess II automated cell counterInvitrogen AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine FixableInvitrogen D7132Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membraneFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucoseSigma-AldrichD5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 surface activation reagentEmulateER-1Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent EmulateER-2Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mmFisher ScientificFB0875713
Gelatin-Based Coating Solution Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
Gentamicin Gibco15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate InvitrogenH3570
Human Collagen Type ISigma-AldrichCC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial CellsCell BiologicsH-6054
Inverted MicroscopeFisher Scientific03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water BathsFisher ScientificFSGPD10
L-Glutamine Gibco25030-081
Luria Broth (LB) agar, MillerSupelcoL3027
L-WRN Cells American Type Culture CollectionCRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048
N-acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific840-274200
NicotinamideSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 Hub ModuleEmulateN/A
ParaformaldehydeThermoFisher047392.9L
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8Rainin17014966
Pod Portable ModuleEmulateN/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit QIAGEN205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated Corning431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter UnitMilliporeSE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70umFisher Scientific22-363-548
Sterile Syringes, 10mLFisher Scientific14-955-453
Straight, fine, sharp point scissorsMiltex InstrumentsMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD CentrifugeThermo Scientific75016052
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787Detergent
TRIzol Reagent Invitrogen15596026RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Gibco12604013Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 Culture ModuleEmulateN/A

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. ....

Explore More Articles

in vitroNEC on a chip

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved