Микрофлюидная модель некротизирующего энтероколита с включением неонатальных кишечных энтероидов человека и дисбиотического микробиома

Summary

Этот протокол описывает in vitro модель некротизирующего энтероколита (НЭК), которая может быть использована для механистических исследований патогенеза заболевания. Он представляет собой микрофлюидный чип, засеянный кишечными энтероидами, полученными из кишечника новорожденного человека, эндотелиальными клетками и кишечным микробиомом новорожденного с тяжелой формой НЭК.

Abstract

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является тяжелым и потенциально смертельным заболеванием кишечника, которое трудно изучать из-за его сложного патогенеза, который остается до конца изученным. Патофизиология НЭК включает нарушение плотных соединений кишечника, повышенную проницаемость кишечного барьера, гибель эпителиальных клеток, микробный дисбиоз и нарушение регуляции воспаления. Традиционные инструменты для изучения НЭК включают животные модели, клеточные линии и органоиды кишечника человека или мыши. Несмотря на то, что исследования с использованием этих модельных систем улучшили понимание патофизиологии заболеваний, их способность повторить сложность НЭК человека ограничена. В настоящее время разработана улучшенная модель NEC in vitro с использованием микрофлюидной технологии, получившая название NEC-on-a-chip. Модель NEC-on-a-chip состоит из микрофлюидного устройства, засеянного кишечными энтероидами, полученными от недоношенного новорожденного, культивируемым совместно с эндотелиальными клетками человека и микробиомом младенца с тяжелой формой НЭК. Эта модель является ценным инструментом для механистических исследований патофизиологии НЭК и новым ресурсом для тестирования на открытие лекарств для лечения кишечных заболеваний новорожденных. В данной рукописи будет приведено подробное описание модели NEC-on-a-chip.

Introduction

Некротизирующий энтероколит (НЭК) поражает недоношенных новорожденных с частотой до 10% у рожденных с массой тела < 1500^г1. Патофизиология НЭК является комплексной и включает повреждение кишечного эпителия, нарушение плотных соединений кишечника, повышение проницаемости кишечного барьера, иммунную дисрегуляцию и гибель эпителиальных клеток ^2,3. Наше понимание механизмов, участвующих в патогенезе НЭК, остается неполным, и, несмотря на десятилетия исследований, до сих пор не существует эффективных таргетных методов лечения.

Существенным препятствием для продвиж....

Protocol

Энтероиды были получены из образцов тонкого кишечника недоношенных детей (родившихся на сроке от 22 до 36 недель беременности), полученных во время операции по поводу НЭК или других кишечных заболеваний невоспалительной этиологии. Весь сбор и обработка образцов осуществлялись после инф.......

Discussion

Эта система NEC-on-a-chip является новым мощным инструментом, который может быть использован для моделирования патофизиологии NEC. Эта платформа обеспечивает сложную микросреду, которая более близка к кишечной среде in vivo , чем предыдущие модели, за счет включения системы кокультивирован.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A