Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגרימת פגיעה אלקלית מדויקת וניתנת לשחזור בקרנית ובגפיים במודל עכבר. לפרוטוקול יש יתרון מכיוון שהוא מאפשר פגיעה מפוזרת באופן שווה בקרנית ובלימבוס של עכבר מעוקל מאוד.

Abstract

הקרנית קריטית לראייה, וריפוי הקרנית לאחר טראומה הוא חיוני לשמירה על שקיפותה ותפקודה. באמצעות חקר מודלים של פגיעות בקרנית, החוקרים שואפים לשפר את הבנתם כיצד הקרנית מחלימה ולפתח אסטרטגיות למניעה וניהול אטימות הקרנית. פגיעה כימית היא אחד ממודלי הפציעה הפופולריים ביותר שנחקרו בהרחבה על עכברים. רוב החוקרים הקודמים השתמשו בנייר שטוח ספוג בנתרן הידרוקסידי כדי לגרום לפגיעה בקרנית. עם זאת, גרימת פגיעה בקרנית ובגפיים באמצעות נייר סינון שטוח אינה אמינה, מכיוון שקרנית העכבר מעוקלת מאוד. כאן, אנו מציגים מכשיר חדש, ניקוב ביופסיה שונה, המאפשר לחוקרים ליצור פגיעה אלקלית מוגבלת היטב, מקומית ומפוזרת באופן שווה בקרנית ובלימבוס. שיטת ניקוב-טרפין זו מאפשרת לחוקרים לגרום לכוויה כימית מדויקת וניתנת לשחזור לכל הקרנית והלימבוס של מורין תוך השארת מבנים אחרים, כגון העפעפיים, ללא השפעה של הכימיקל. יתר על כן, מחקר זה מציג טכניקת enucleation המשמרת את הקרונקל המדיאלי כציון דרך לזיהוי צד האף של כדור הארץ. הבולבר והלחמית המישושית, ובלוטת הדמעות נשמרים גם הם שלמים באמצעות טכניקה זו. בדיקות עיניים בוצעו באמצעות ביומיקרוסקופ של מנורת סדק וצביעת פלואורסצאין בימים 0, 1, 2, 6, 8 ו-14 לאחר הפציעה. ממצאים קליניים, היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים אישרו מחסור בתאי גזע לימבליים וכשל בהתחדשות פני השטח של העין בכל עכברי הניסוי. מודל הפגיעה בקרנית אלקלית המוצג אידיאלי לחקר מחסור בתאי גזע לימבליים, דלקת בקרנית ופיברוזיס. שיטה זו מתאימה גם לחקירת יעילות פרה-קלינית וקלינית של תרופות אופתלמולוגיות מקומיות על פני הקרנית.

Introduction

הקרנית קריטית לראייה ובעלת מאפיינים ייחודיים, כולל שקיפות, שהיא תנאי מוקדם לראייה ברורה. בנוסף לתפקיד המגן העיקרי, הקרנית מהווה 2/3 מכוח השבירה של העין1. בשל תפקידו המשמעותי בראייה, פגיעות ואטימות בקרנית גורמות לירידה משמעותית בראייה ואחראיות לגורם השני בגובהו לעיוורון הניתן למניעה בעולם 2,3. בפגיעות בקרנית עם תפקוד גפי חמור, תפקוד המחסום של הלימבוס פוחת, וכתוצאה מכך נדידת תאי הלחמית לכיוון פני הקרנית ולחמית הקרנית 4,5, מה שפוגע בראייה באופן דרמטי. לפיכך, נדרשות אסטרטגיות מניעה וטיפול יעילות כדי להתמודד עם הנטל העולמי של עיוורון הקרנית והנכות הנלווית אליו.

ההבנה הנוכחית של תהליך ריפוי פצעי הקרנית האנושית מבוססת על מחקרים קודמים שבדקו את תגובות הקרנית לפציעות שונות. מספר טכניקות ומודלים של בעלי חיים שימשו כדי לגרום לפציעות כימיות או מכניות שונות בקרנית 6,7,8,9 ולחקור היבטים שונים של תהליך ריפוי פצעי הקרנית.

מודל הכוויה האלקלית הוא מודל פציעה מבוסס היטב המבוצע על ידי מריחת נתרן הידרוקסידי (NaOH) על פני הקרנית ישירות או באמצעות נייר סינון שטוח10. פגיעה אלקלית גורמת לשחרור מתווכים פרו-דלקתיים וחדירה של תאים פולימורפו-גרעיניים לא רק בקרנית ובחדר הקדמי של העין אלא גם ברשתית. זה גורם לאפופטוזיס לא מכוון של תאי גנגליון ברשתית והפעלת תאי CD45+ 11. לכן, קריטי למקם את מקום הפציעה בדיוק כדי למנוע פגיעה מוגזמת ולא מכוונת באמצעות מודל פציעה אלקלי.

אורך הציר של גלגל העין המורין הוא כ 3 מ"מ12. בשל המרחק הקצר הזה בין הקרנית לרשתית, קיימת עקמומיות קרנית תלולה המספקת כוח שבירה גבוה כדי למקד את האור ברשתית (איור 1A). כפי שדיווחנו בעברעל 13, קשה לגרום לפגיעה כימית במשטח המעוגל מאוד הזה באמצעות נייר סינון שטוח, במיוחד בלימבוס (איור 1B). גרימת פגיעה בלימבוס דורשת הטיית נייר הסינון, שיש לו פוטנציאל לגרום לפגיעה בלתי מכוונת בפורניקס ובלחמית הסמוכה14. גישה אחרת כוללת יישום ישיר של החומר הכימי כטיפות על פני הקרנית. עם זאת, שיטה זו חסרה שליטה על זמן החשיפה, וקיים סיכון פוטנציאלי לגרימת פגיעה בלחמית, בפורניקס ובעפעפיים עקב פיזור הנוזל לאזורים אלה.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, מחקר זה מציג שיטת אגרוף-טרפין חדשנית לגרימת פציעה. לטכניקה זו מספר יתרונות, כולל (i) גרימת פגיעה כימית יעילה לכל משטח הקרנית והלימבוס במודל עכבר, (ii) גרימת פגיעה מקומית ומוגבלת היטב לקרנית, (iii) היכולת למרוח כל נוזל מעניין למשך זמן קבוע מראש, ו-(iv) היכולת לגרום לגדלים שונים של פציעות בקרנית על ידי בחירת אגרופי ביופסיה מתאימים. שיטה זו אפשרית גם עבור מודלים של פציעות חולדות וארנבות, המציגים גם משטח קרנית מעוקל והם מודלים נפוצים של בעלי חיים המשמשים לחקר ריפוי פצעים על פני השטח של העין.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לטיפול בבעלי חיים במעבדה של סטנפורד APLAC מספר 33420, שימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות, והצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. 10 עכברים זכרים ונקבות C57BL/6 בגילאי 8-12 שבועות סופקו בנדיבות על ידי מעבדת אירווינג ל. וייסמן. בעלי החיים התאקלמו למחזור אור-חושך של 12 שעות וסופקו להם מים ומזון עד לליביטום. הפגיעה נגרמה לעין אחת של החיה.

1. הכנה לניסוי

  1. הכנת חומרים
    הערה: יש לשמור את כל הריאגנטים בטמפרטורת החדר.
    1. מכינים את האגרוף-טרפין: מכינים ניקוב ביופסיה בקוטר של 3.5 מ"מ ומסמנים את מוט הניקוב במרחק של 5 מ"מ מהקצה הדיסטלי שלו. הצמד את האגרוף בחוזקה וחתך את החלק הדיסטלי המסומן של הפיר שלו באמצעות כלי סיבובי דו-מהיר. ללבוש הגנה עינית במהלך תהליך זה. חותכים את הפיר בעומק 3.5 מ"מ ומשאירים את 1.5 מ"מ הסופי מחובר. כופפו את הקצה ב-90°, כפי שמוצג באיור 1.
    2. הכן תמיסת 0.5 M NaOH על ידי המסת 1 גרם NaOH ב 50 מ"ל מים מזוקקים.
    3. הכינו 10 מ"ל של קוקטייל הרדמה על ידי שילוב של 2 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל קטמין ו-1 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל קסילזין. לפני ההזרקה, לדלל את התערובת עם 7 מ"ל של 0.9% NaCl (מלוחים רגילים).
    4. הכן תמיסת נתרן פלואורסצאין 0.1% על ידי הוספת 0.1 מ"ל של 10% נוזל פלואורסצנטי AK-Fluor ל 9.9 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (1x PBS).
    5. הכינו PBS (1x) על ידי המסת 8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4 ו-0.23 גרם NaH2PO4ב-900 מ"ל מים מזוקקים. התאם את ה- pH של הפתרון ל -7.4. הביאו את התמיסה לנפח סופי של 1 ליטר על ידי הוספת מים מזוקקים.
    6. הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע. תחת מכסה מנוע כימי, להמיס 2 גרם PFA ב 45 מ"ל של PBS. מחממים את התערובת ל-65 מעלות צלזיוס ומדרגים את רמת החומציות שלה ל-7.4. לאחר שה-PFA התמוסס, הביאו את הפתרון לנפח סופי של 50 מ"ל.

2. הכנת בעלי חיים

  1. שקול את העכבר כדי לקבוע את הנפח המתאים של קוקטייל הרדמה בהזרקה להזרקה. לאחר טיפול וריסון נאותים של העכבר כמתואר במכהולץ ואחרים 15, יש לתת את קוקטייל ההרדמה תוך צפקי (IP) במינון של 0.01 מ"ל/גרם16,17. יש לכוון את רבעי הבטן הנחותים להזרקת IP כדי למנוע נזק לאיברים.
  2. הזריקו תרחיף בופרנורפין בשחרור מורחב (3.25 מ"ג/ק"ג) תת עורית לשיכוך כאבים נוסף במהלך הניתוח ולאחריו, שכן פגיעה אלקלית בקרנית כואבת ביותר.
  3. המתן עד שיושג מישור עמוק של הרדמה. בדוק חוסר תגובה לצביטה בבוהן כאינדיקציה למישור עמוק מוצלח של הרדמה. יש למרוח משחת עיניים פשוטה על העין הנגדית כדי למנוע ממנה יובש לפני תחילת הניתוח.
  4. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר על שולחן הניתוחים שהוכן על פי עקרונות ניתוח מכרסמים סטנדרטיים18. הניחו כרית בגובה 5 מ"מ מתחת לראשו של המכרסם, הממוקמת במצב דקוביטוס רוחבי. הכרית מסייעת לתמוך בראש המכרסם במהלך הניתוח.
  5. יש לתת טיפות עיניים טטרקאין הידרוכלוריד (0.5%) להרדמה נוספת. יבש כראוי את משטח העין עם חנית עין כירורגית וקצץ את הריסים.

3. אינדוקציה של פגיעה אלקלית

  1. לפני תחילת הניתוח, יש לארגן את טבלת הניתוחים בהתאם לעקרונות ניתוחי מכרסמיםסטנדרטיים 18,19 ולשמור על שדה ניתוח סטרילי במהלך הניתוח. מקם את המיקרוסקופ הכירורגי כדי לדמיין כראוי את העכבר המרדים ולהתאים את הטיימר ל -30 שניות. הניחו מגבת נייר מעוותת על לוע בעל החיים כדי למנוע שאיפת אף לא מכוונת במהלך תהליך השטיפה.
  2. קבע את היקף אזור הגפיים באמצעות המיקרוסקופ הכירורגי תוך הקפדה על כך שעפעפיו של העכבר פתוחים לרווחה באמצעות האגודל והאצבעות המורה. החזיקו בעדינות את האגרוף-טרפין הנקי במקביל לציר העין, מבלי להפעיל לחץ כלפי מטה. הימנע מסיבוב הכלי ושמור על ציר האגרוף-טרפין מקביל לציר כדור הארץ.
  3. בקשו מהעוזר המנתח לזרוק 3 טיפות של תמיסת NaOH (שווה ערך ל-40 מיקרוליטר) לתוך חור האגרוף-טרפין כדי למלא את הכלי ולכסות את פני הקרנית בהתאם. מתח הפנים של הנוזל מונע דליפה החוצה מהמכשיר (איור 1).
    הערה: השתמשנו במזרק 1 מ"מ עם מחט 27G הכוללת קצה שטוח בזווית של 50° כדי להפיל בזהירות את תמיסת NaOH.
  4. לאחר 30 שניות, מיד לשטוף את הקרנית ואת fornix עם 5 מ"ל של PBS (1x). סרטון 1 מדגים את ההליך לגרימת פגיעה כימית.
  5. השתמש בנייר מחוון pH אוניברסלי כדי להבטיח pH של 7 - 7.5 על פני הקרנית של העין הפגועה. לאחר מכן, החל את משחת העיניים האנטיביוטית המשולשת על פני השטח של העין הפגועה כימית.
    הערה: תנועת זנב במהלך ניתוח היא סימן לעומק הרדמה נמוך. יש למרוח קוקטייל הרדמה נוסף (קטמין + קסילזין) על ידי הזרקת חומר הרדמה [בולוס IP (50% מהנפח הראשוני)].
  6. לאחר הניתוח, לאשר כי העכבר במצב יציב. מתן buprenorphine השני אם החיה סובלת מכאבים. השתמש באותה טכניקת טיפול כמו ב- 2.2. התחל את הבדיקה שלאחר הניתוח בזמן שהחיה נמצאת תחת הרדמה.
  7. לאחר ההליך, לשטוף, לייבש ולחטא את האגרוף טרפין ואת שולחן הניתוחים עם אתנול 70%.

4. הערכה קלינית

  1. לבדיקה, מרדים את העכבר כפי שתואר קודם לכן בשלב 2.1.
  2. בחנו את העיניים (פצועות ולא פצועות) תחת מיקרוסקופ של מנורת חריץ. השתמש במצלמה כדי ללכוד תמונות (במחקר זה נעשה שימוש במצלמת טלפון במצב קולנועי).
  3. ציון אטימות הקרנית על פי מערכת הדירוג Yoeruek20: 0 = קרנית רגילה ושקופה; 1 = אטימות קלה; 2 = אטימות גדולה יותר, אך ניתן להבחין בקלות בקשתית ובאישון; 3 = הקשתית והאישון בקושי ניתנים להבחנה; 4 = הקרנית אטומה לחלוטין עם אישון בלתי נראה.
  4. יש למרוח טיפות עיניים פלואורסצאין 0.1%. יבש עודף נוזל פלואורסצנטי עם מוליך כותנה ולהעריך נוכחות של פגמים אפיתל הקרנית באמצעות מסנן כחול קובלט. צלם תמונות.
  5. עקוב אחר בעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. אין להחזיר את בעל החיים לבעלי חיים אחרים עד שהוא מחלים לחלוטין.

5. חינוך

  1. המתת חסד עכברים שבועיים לאחר השראת פגיעה כימית על ידי נקע צוואר הרחם ב 3-5 s21.
  2. יש לחנך את העין תוך שמירה על הקרונקל המדיאלי והלחמית הפאלפברלית כולה בסדר הבא, כפי שניתן לראות בסרטון 2.
  3. תחת המיקרוסקופ הכירורגי, לנתח בזהירות את צומת של caruncle ועור. בעזרת מלקחיים מושכים את הקרונקל ומכוונים את קצה המספריים הכירורגיים מתחת ללחמית המישושית לעבר הצטלבותו עם לוחית הטרסל.
  4. חותכים את הלחמית לאורך קו ההדבקה לכיוון הקנטוס הצידי. לאחר מכן, סובב את המספריים הכירורגיים לצומת של הלחמית ואת צלחת tarsal נחותה במישור subconjunctival.
  5. לאחר השלמת דיסקציה הלחמית, הסירו את העפעפיים העליונים והנחותים מצד האף עם האגודל והאצבעות המורה. בזמן הנסיגה, יש לכוון את קצה הפינצטה המעוקלת מאחורי הדמעות הבולטות לכיוון עצב הראייה. אחזו היטב בעצב הראייה וחלצו את כדור הארץ (איור 2).
  6. שטפו את הגלובוס עם PBS (1x) והעבירו אותו לתמיסת הקיבוע.

6. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וחומצה תקופתית שיף (PAS)

  1. מקבעים את הגלובוסים בתמיסת 10% פורמלין למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  2. יש לייבש את הרקמות באמצעות סדרה רציפה של אלכוהול מדורג בריכוזים של 70% אתנול, 80% אתנול, 90% אתנול ו-100% אתנול, כל אחד למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, לטבול את העיניים xylene במשך 10 דקות. לבסוף, לעטוף את העיניים בפרפין.
  3. חתכו את קוביות הפרפין לפרוסות בעובי 6 מיקרומטר והרכיבו אותן על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית להמטוקסילין ואוזין (H&E) ולצביעת חומצה שיף תקופתית (PAS), כמתואר בקובץ משלים 1.

7. הדמיה וניתוח אימונופלואורסנציה

  1. עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיה (IHC), לתקן את העיניים ב 1 מ"ל של PBS (1x) המכיל 4% PFA ב 4 ° C במשך הלילה. שטפו את הדגימה 3x ב 1 מ"ל של PBS (1x) במשך 5 דקות כל אחד.
  2. כדי למנוע היווצרות גבישי קרח ולהגן על המבנים המולקולריים של החלבונים, בצע רוויית סוכרוז סדרתית עם ריכוזי 10% סוכרוז, 20% סוכרוז ו-30% סוכרוז ב-PBS. הטמעת הגלובוסים בתמיסת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT; איור 2), ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
  3. חתכו את בלוק ה-OCT לפרוסות בעובי 12 מיקרומטר והרכיבו על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לצביעת IHC.
  4. חדירת מקטעי רקמה בשקופיות מיקרוסקופ ב-0.1% Triton X -100 ב-PBS (1x) למשך 15 דקות. לאחר מכן, חסום אנטיגנים לא ספציפיים עם 5% BSA ב- PBS (1x) למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר.
  5. לדגור על קטעי רקמה בשקופיות מיקרוסקופ ב 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה בקוקטייל של נוגדנים ראשוניים המטרה מוכן PBS (1x) המכיל 1% BSA. בניסוי זה, הנוגדנים העיקריים היו נוגדנים 1:100 מדוללים נגד קרטין 13 (K13) ונוגדנים נגד קרטין 12 (K12) עם ריכוז של 2.24 מיקרוגרם/מ"ל ו-1.56 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה.
  6. לאחר הדגירה, שטפו את חלקי הרקמה בשקופיות מיקרוסקופ 3x עם PBS (1x). לאחר מכן, לזהות נוגדנים ראשוניים קשורים עם 1:500 חמור מדולל נגד ארנב-IgG. לדגור עם הנוגדן המשני ב 4 ° C במשך 1 שעה בחושך. לאחר מכן יש לשטוף ב-PBS (1x) 3x למשך 5 דקות כל אחד.
  7. יש למרוח טיפה של מדיום הרכבה פלואורסצנטי נגד דהייה המכיל DAPI על חלקי הרקמה במיקרוסקופ ולכסות בכיסוי. אפשרו לדגימות להתייבש בחושך ובחנו אותן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אותה הגדרת לייזר לעיניים רגילות ופצועות.

Representative Results

יעילות השיטה בגרימת מחסור בתאי גזע לימבליים (LSCD) הוערכה על ידי הערכת הסימנים הקליניים וההיסטולוגיים של LSCD. ההערכה הקלינית נעשתה באמצעות מיקרוסקופ מנורות חריץ והדמיית טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית קדמית (AS-OCT) (איור 3 ואיור 4).

אפיתל מחדש התרחש באופן צנטריפטלי והיה מהיר יותר בחלק הרקתי של הקרנית בהשוואה לחלק האף שלה. עיניים פגועות פיתחו אובך קרנית 2+-3+ מיד לאחר פגיעה כימית (איור 3). תאי אפיתל נדדו מהלחמית אל פני הקרנית בעקבות פגיעה בגפיים. הפגם הגדול באפיתל הקרנית עבר אפיתל מחדש לחלוטין בימים 12-14, מה שלקח זמן רב יותר בהשוואה לפגיעה באפיתל הקרנית בגודל דומה ובקרום מרתף שלם וסטרומה שבדרך כלל נרפא תוך 5 ימים לאחר הפציעה 8,9. כתוצאה מ-LSCD, 50% מהעיניים הפגועות פיתחו מומי אפיתל מתמשכים בסוף השבוע השני (איור 3). בצקת בקרנית הייתה בולטת יותר בימים הראשונים (איור 3, איור 4), ואילו פיברוזיס בקרנית היה משמעותי בשבוע השני שהביא לאטימות קרנית של 4+ ב-100% מהעיניים הפגועות.

סימנים מוקדמים של ניאו-וסקולריזציה (NV) נצפו קלינית והיסטולוגית, 24 שעות לאחר השראת פגיעה כימית, כפי שמודגם באיור 5, בהתאם לציר הזמן של NV שזוהה על ידי Kvanta et al. מחקר שהראה סימן של NV לימבלי 24 שעות לאחר פציעה22. במהלך תהליך ההחלמה, כלי דם חדשים הבשילו וביום ה -14 לאחר הפציעה, NV חצה את הלימבוס והגיע למרכז הקרנית. הלימבוס, המגדיר את הגבול בין הלחמית לקרנית, נהרס.

עדות היסטולוגית למחסור בתאי גזע לימבליים ולחמית נצפתה על ידי הופעת תאי גביע PAS+ וכלי דם סטרומה 23,24,25,26. תאי גביע נצפו במודל הפציעה הנוכחי וסומנו על-ידי החץ באיור 6.

אפיתל הלחמית והקרנית מבטא בעיקר קרטינים ייחודיים, K13 ו-K12, בהתאמה27. לאחר הפגיעה הגפיים, תאי אפיתל חדשים שמקורם בלחמית כיסו את הקרנית הצפופה, ו-K12 לא בא לידי ביטוי על פני הקרנית של בעלי חיים פצועים במשך שבועיים לאחר הפציעה. ממצא זה, העולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים28, הצביע על LSCD מלא והיעדר תאי אפיתל בקרנית על פני הקרנית. עם זאת, במחקר שנערך על ידי פארק ואחרים 29, הם זיהו ביטוי K12 20 ו -32 שבועות לאחר הפציעה, מה שמרמז על התמיינות טרנס אפשרית של תאי האפיתל.

כתוצאה מכך, ראינו כי פגיעה כימית הרסה את הלימבוס ואת תאי הגזע הלימבליים, מה שהביא לנדידה של תאי אפיתל הלחמית למרכז הקרנית כדי לכסות את פני הקרנית הצפופים. זה מאומת עוד יותר על-ידי סמן תאי האפיתל של הלחמית, K13, שהתבטא בכל משטחי הלחמית והקרנית כפי שמוצג באיור 7.

figure-representative results-3000
איור 1: עין ימין רגילה של עכבר והאגרוף-טרפין לגרימת פגיעה בקרנית ובגפיים. (A) מבט רוחבי המראה עין עכבר עם קרנית מעוקלת מאוד (ראשי חץ מציינים את הלימבוס). (B) התמונה מראה שאפילו נייר סינון גדול אינו מספיק כדי לכסות כראוי את אזור הגפיים. קוטר הלימבוס עד הלימבוס של עין העכבר הוא כמעט 4 מ"מ וביופסיה של ניקוב בקוטר חיצוני של 4.5 מ"מ וקוטר פנימי של 3.5 מ"מ (לוחות D ו-H), מכסה כראוי את פני הקרנית והגפיים כפי שמוצג בלוחות (C) ו-(E). (F) האגרוף-טרפין מוחזק כראוי על פני כדור הארץ סביב אזור הלימבל. (G) כדי להבטיח שאין דליפה דרך קצה הפאנץ'-טרפין, לאחר מיקום מתאים של הפאנץ'-טרפין בציר מקביל לגלובוס, החור מתמלא בכחול מתילן. לא מזוהה דליפה של מתילן כחול. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-4150
איור 2: עיניים מלומדות. (A) העיניים עברו אינקולציה תוך שמירה על הלחמית הבולברית והמישושית, בלוטת הדמעות (ראש החץ) ועצב הראייה (חץ). העיניים הרגילות (B) והפצועות (C) היו רוויות ב-30% סוכרוז כדי להגן מפני היווצרות קריוגבישים. ניתן לזהות את חלק האף של כדור הארץ דרך האף (מסומן N). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-4845
איור 3: ריפוי פצעים בעין שמאל. תהליך ריפוי הפצע של עין העכבר השמאלית במשך שבועיים לאחר פגיעה אלקלית בקרנית ובגפיים במודל עכבר מוצג כאן (A-F). בדיקת מנורת החריץ של העין. בצקת בקרנית בולטת יותר בימים 0 ו-2 (A,B), ואילו פיברוזיס בולטת יותר בשבוע השני שלאחר הפציעה (E-F). A.f-F.f מראים את תהליך האפיתל מחדש של אותה עין. פגם אפיתל כולל בקרנית ובגפיים מיד לאחר השראת הפציעה נצפה ב- A.f. פגם אפיתל נרפא על ידי נדידת תאי אפיתל הלחמית בתבנית צנטריפטלית על ידי 12-14 ימים (A.f-F.f). עם זאת, 50% מהעיניים הפגועות פיתחו פגם אפיתל מתמשך בסוף השבוע השני, כפי שניתן לראות בחץ בתמונות F ו-F.F. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ (לוח C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-5835
איור 4: OCT של המקטע הקדמי של עין העכבר. (A) AS-OCT מדגים עקמומיות קרנית תקינה והחדר הקדמי. מבנה הקשתית מוגדר היטב וניתן לזיהוי. לא ניתן להבחין בהידבקות אירידוקרנית באמצע הפריפריה של הקשתית. (B) מיד לאחר הפציעה עובי הקרנית עולה עקב היווצרות בצקת ומתפתחת הידבקות אירידוקרנית בפריפריה האמצעית של הקשתית. (C) שבועיים לאחר הפציעה עקמומיות הקרנית השתנתה וניתן לראות הידבקות אירידוקרנית מוחלטת עם הרס החדר הקדמי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-6659
איור 5: ניאו-וסקולריזציה של הקרנית. סימנים קליניים והיסטולוגיים של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית ניתן לראות במהלך תהליך ריפוי הפצע לאחר פגיעה בנתרן הידרוקסידי (NaOH). (A) הסימנים הראשוניים של ניאו-וסקולריזציה ניתנים לזיהוי ביום הראשון לאחר הפציעה, המאופיינים בשינוי צבע אדמדם של הקרנית (מסומן בחץ לבן). שינוי צבע זה נובע מצבירה של תאי דם אדומים בסטרומה, כפי שמודגם בתמונה היסטולוגית תואמת (D) (מסומנת על ידי ראשי חץ צהובים). (B) במהלך השבוע הראשון של ההתחדשות, כלי דם חדשים גדלים בהדרגה ומתפשטים ברחבי הקרנית. (C) בתום שבועיים, אזור הלימבל נהרס, וכלי הדם החדשים ממשיכים להתפתח. (E) החלק ההיסטולוגי של הקרנית ממחיש עוד יותר את נוכחותה של ניאו-וסקולריזציה של סטרומה עמוקה (מוצגת על-ידי ראשי חץ). מנורת סדק סרגל קנה מידה של תמונה = 1 מ"מ, סרגל קנה המידה של תמונת היסטולוגיה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-7874
איור 6: צביעה תקופתית של קרנית חומצה-שיף ואימונוהיסטוכימיה (IHC). צביעה תקופתית של חומצה שיף ואימונוהיסטוכימיה של הקרנית הרגילה והפצועה נעשתה שבועיים לאחר הפציעה. אפיתל קרנית עכבר רגיל המורכב מ 4-5 שכבות של תאים (A). פגיעה אלקלית בקרנית ובלימבוס הובילה ללחמית של הקרנית עם הופעת תאי גביע על פני הקרנית כפי שמוצג על ידי חצים שחורים ב-(D). תאי אפיתל תקינים בקרנית מבטאים K12 (B), שאינו מבוטא על ידי תאי הלחמית המכסים את הקרנית הפגועה (E). K13, סמן אופייני של תאי אפיתל לחמית, אינו מבוטא על תאי אפיתל הקרנית הרגילים (C). עם זאת, הוא קיים על פני הקרנית הפגועים נתרן הידרוקסידי (NaOH) המהווה סימן ללחמית הקרנית (F). סרגל קנה מידה של תמונה היסטולוגיה = 50 מיקרומטר, סרגל קנה מידה של תמונה מוכתמת IHC = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-9032
איור 7: המטוקסילין ואאוזין וצביעה אימונוהיסטוכימית. נעשה המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה אימונוהיסטוכימית של רקמת הלימבוס הרגילה והפגועה. (A) הלימבוס התקין מסמן את אזור המעבר בין קצה לובן העין לתחילת הקרנית. אזור זה מכוסה בדרך כלל על ידי שכבה אחת או שתיים של תאי אפיתל הלחמית (מסומן על ידי החיצים). בעין בריאה, הביטוי של סמן אפיתל קרנית ספציפי הנקרא K12 מתחיל בלימבוס ומשתרע על פני השטח של הקרנית (מוצג בתמונה B). מצד שני, הביטוי של סמן לחמית המכונה K13 מוגבל ללימבוס ואינו משתרע מעבר לו (מסומן על ידי החץ הלבן בתמונה C). בעיניים שנפגעו מנתרן הידרוקסידי (NaOH), גבולות הלימבוס משתבשים. זה מוביל לנדידה של תאי הלחמית לכיוון הקרנית הפגועה. (D) התמונות של הלימבוס הפגוע NaOH מדגימות נוכחות של ניאו-וסקולריזציה הן מתחת לשכבת האפיתל והן בתוך רקמת הסטרומה. לאחר הפציעה, פני הקרנית הפגועים חסרים נוכחות של K12 (E), בעוד K13 מבוטא בשפע על פני הקרנית (F). סרגל קנה מידה של תמונה היסטולוגיה = 50 מיקרומטר, סרגל קנה מידה של תמונה מוכתמת IHC = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: פרוטוקול צביעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון 1: פגיעת קרנית וגפיים NaOH במודל עכבר עם אגרוף-טרפין. הסרטון מדגים את ההליך של גרימת פגיעה בקרנית ובגפיים NaOH במודל עכבר עם אגרוף-טרפין. חשוב להחזיק את האגרוף-טרפין בציר מקביל עם כדור הארץ ולהפעיל לחץ מינימלי על הלימבוס. טכניקה נכונה זו חיונית למניעת דליפה ולהשגת תוצאות אופטימליות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון 2: המחשה של טכניקת האינקולציה תוך שמירה על לחמית הבולבר. כדי להבדיל בין צד האף של כדור הארץ לבין הצד הטמפורלי, האף נשמר יחד עם הגלובוס. הלחמית כולה מחולקת החל מהצומת שלה ועד לצלחת הטרסלית. עם לחץ מינימלי, התוכן המסלול בולט כלפי חוץ. על ידי הנחיית המלקחיים לכיוון החלק האחורי של כדור הארץ, עצב הראייה נתפס, והרקמה מופקת. הרקמה כוללת את כדור הארץ, שומן אורביטלי ובלוטת הדמעות המסלולית. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Discussion

מחקר זה מציע מכשיר חדשני, הפונץ'-טרפין, אשר ניתן להשתמש בו כדי לגרום בהצלחה לפגיעה יעילה וניתנת לשחזור בקרנית ובגפיים במודל עכבר. מודל חסר בתאי גזע לימבליים זה אידיאלי לחקר הדינמיקה של ריפוי פצעי הקרנית והלחמית לאחר פציעה.

עדויות מצביעות על כך שגם הגומחה הלימבלית וגם החלק המרכזי של הקרנית המורין מכילים תאי גזע30. לכן, נדרשת פגיעה יעילה בקרנית ובגפיים כדי לייצר מודל חסר בתאי גזע, ומודל הפגיעה המוצג כאן מאפשר חשיפה של הלימבוס המעוגל של הקרנית לחומר כימי לתקופה מסוימת. כדי לקבוע את הריכוז ומשך הזמן הטובים ביותר של פגיעת NaOH, נגרמו פציעות עם ריכוזים ומשכי זמן שונים של NaOH. ריכוזי NaOH גבוהים יותר או משכי חשיפה ארוכים יותר גרמו לנזק מוגבר לרקמות ולפיברוזיס. לכן, החוקרים יכולים להתאים פרמטרים אלה בהתבסס על המטרות הספציפיות של המחקר שלהם ואת חומרת הפציעה הרצויה.

כדי לשחזר בהצלחה את מודל הפגיעה בקרנית ובגפיים, יש לקחת בחשבון מספר שיקולים מרכזיים. ראשית, חובה למדוד את קוטר הלימבל עד הלימבל של עין היעד כדי לקבוע את הגודל המתאים של האגרוף. מומלץ לבחור ניקוב ביופסיה בקוטר חיצוני הגדול ב-0.5-1 מ"מ מקוטר זה.

מתח הפנים של הנוזל שבו משתמשים הוא גורם חשוב במניעת דליפה בממשק שבין משטח העין לקצה טרפין הניקוב, כפי שמוצג באיור 1G. לכן, אין צורך להפעיל לחץ על קצה ביופסיית האגרוף.

כדי להימנע מגרימת נזק מכני לרקמה, חשוב להחזיק את האגרוף טרפין בציר מקביל עם העין ולהימנע מהפעלת לחץ על הלימבוס. התאמה לא נכונה של ציר הניקוב עלולה להגביר את הסיכון לדליפה ולגרום לאתר פציעה ותוצאות לא מדויקות.

כמה מגבלות אפשריות של טכניקה זו כוללות את הצורך לבחור את גודל האגרוף המתאים, רכישת מיומנות בהחזקת האגרוף טרפין והסיכון הפוטנציאלי לגרימת פציעה מכנית. עם זאת, ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות תרגול ועל ידי ביצוע ההוראות המפורטות בפרוטוקול זה. הזן וטווח הגילאים של העכברים הם גורמים נוספים המשפיעים על תהליך האפיתל מחדש ויש לקחת אותם בחשבון במחקר.

יתר על כן, הפרוטוקול המוצע הוא יתרון שכן הוא מפרט שיטת enucleation המשמרת את הלחמית bulbar ו palpebral ומאפשר קביעת החלק האף של העולם ללא יישום של תפרים כירורגיים כסמן. מחקרים קודמים הצביעו על כך שאזור האף של העין הוא בעל העצבוב העצבי הנמוך ביותר בהשוואה לאזורים אחרים בקרנית, מה שהופך אותו לפגיע יותר לניאו-וסקולריזציה וליעילות רגנרטיבית מופחתת31,32.

לסיכום, הסימנים הקליניים של LSCD, כגון אטימות הקרנית (CO), פגמים אפיתליאליים מתמשכים, וניאו-וסקולריזציה של הקרנית (NV), יחד עם השינויים ההיסטולוגיים שנצפו, כולל מטאפלזיה של תאי גביע, ביטוי של K13 על פני הקרנית, והיעדר K12 על פני הקרנית, מאשרים את נוכחותו של LSCD במודל זה. ממצאים אלה מספקים ראיות לכך שטכניקה חדשנית זו יעילה בגרימת LSCD. מודל פגיעה כימית זה יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים כדי לחקור תרופות חדשות וטיפולים תרופתיים בתחום הפגיעה וההתחדשות של הקרנית.

Acknowledgements

אנו מכירים בכך ש-NEI P30-EY026877 תומך במחקר זה. אנו מודים מאוד לשרלין וואנג ולמעבדת ד"ר אירב וייסמן במכון לביולוגיה של תאי גזע ורפואה רגנרטיבית באוניברסיטת סטנפורד על כל עזרתם האדיבה באספקת חיות ניסוי. אנו מעריכים את עזרתו של היראד רזאיפור בהכנה ובעריכה של התמונות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-K12 antibodyABCAMab185627
Anti-K13 antibodyABCAMab92551
Bovine serum albumin (BSA)ThermoFisher ScientificB14
C57BL/6 miceDr Weissman Lab, Stanford University
Curved forcepsStorzE1885
Disposable 90 degree bent needle
Disposable biopsy punchMed blades
Donkey anti-rabbit IgG H&LABCAMab150073
EthanolThermoFisher ScientificT038181000CS
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension)Fidelis Animal Health
Heating pad for mouse 
Ketamine hydrochlorideAmblerANADA 200-055
OCTTissue-Tek 4583
Ophthalmic surgical scissors
pH Indicator SticksWhatman
Phosphate buffered saline (PBS)ThermoFisher ScientificAM9624
Prolong gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935
Slit-lamp microscopeNIDEKSL-450
Sodium fluorescein AK-fluor 10%DailymedNDC17478-253-10
Sterile irrigation solution (BSS)Alcon9017036-0119
Sterile syringe, 1 and 5 ml
Straight forcepsKatena K54550- Storz E1684
Surgical eye spearsAmerican White 17240 Cross
Surgical microscopeZeiss S5 microscope
Tetracaine ophthalmic dropAlcon   NDC0065-0741-14
Timer
Triple antibiotic ophthalmic ointmentBausch and Lomb
TritonX -100Fisher Scientific  50-295-34
Two-speed rotary tool200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit
XylazineAnaSedNADA#139-236

References

  1. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  2. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  3. Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C. Corneal blindness and xenotransplantation. Xenotransplantation. 21 (2), 99-114 (2014).
  4. Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
  5. Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 21 (1 Pt 1), 135-142 (1981).
  6. Shah, D., Aakalu, V. K., Das, H. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. , 175-181 (2021).
  7. Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Mouse models of corneal scarring. Fibrosis: Methods and Protocols. 1627, 117-122 (2017).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  9. Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
  10. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  11. Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
  12. Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
  13. Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
  14. Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
  15. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
  16. Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
  17. Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  18. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in Aseptic Rodent Surgery. Current Protocols in Immunology. 1, 1.12.1-1.12.14 (2008).
  19. ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
  20. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  21. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  22. Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
  23. Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
  24. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
  25. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  26. Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
  27. Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
  28. Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
  29. Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
  30. Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
  31. McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
  32. He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved