Этот протокол описывает метод индуцирования точного и воспроизводимого повреждения роговицы и лимбальной щелочи на мышиной модели. Преимущество протокола заключается в том, что он позволяет равномерно распределить повреждение сильно изогнутой роговицы и лимба мыши.
Роговица имеет решающее значение для зрения, и заживление роговицы после травмы имеет основополагающее значение для поддержания ее прозрачности и функции. Изучая модели повреждений роговицы, исследователи стремятся улучшить свое понимание того, как заживает роговица, и разработать стратегии для предотвращения и лечения помутнений роговицы. Химическая травма является одной из самых популярных моделей травмы, которая была широко изучена на мышах. Большинство предыдущих исследователей использовали плоскую бумагу, смоченную в гидроксиде натрия, чтобы вызвать повреждение роговицы. Однако индуцирование повреждения роговицы и лимба с помощью плоской фильтровальной бумаги ненадежно, так как роговица мыши сильно изогнута. Здесь мы представляем новый инструмент, модифицированный биопсийный пуансон, который позволяет исследователям создать хорошо очерченное, локализованное и равномерно распределенное щелочное повреждение роговицы и лимба мыши. Этот метод удара трепаном позволяет исследователям вызвать точный и воспроизводимый химический ожог всей роговицы и лимба мыши, оставляя другие структуры, такие как веки, незатронутыми химическим веществом. Кроме того, в этом исследовании представлена техника энуклеации, которая сохраняет медиальный карункул в качестве ориентира для идентификации носовой стороны земного шара. Бульбарная и пальпебральная конъюнктива, слезная железа также сохраняются нетронутыми с помощью этой техники. Офтальмологические исследования проводили с помощью щелевого лампового биомикроскопа и флуоресцеинового окрашивания на 0, 1, 2, 6, 8 и 14 сутки после травмы. Клинические, гистологические и иммуногистохимические данные подтвердили дефицит лимбальных стволовых клеток и недостаточность регенерации глазной поверхности у всех подопытных мышей. Представленная модель щелочного повреждения роговицы идеально подходит для изучения дефицита лимбальных стволовых клеток, воспаления роговицы и фиброза. Этот метод также подходит для исследования доклинической и клинической эффективности местных офтальмологических препаратов на поверхности роговицы мышей.
Роговица имеет решающее значение для зрения и обладает уникальными характеристиками, в том числе прозрачностью, которая является необходимым условием для четкого зрения. Помимо того, что роговица выполняет важную защитную роль, на нее приходится 2/3 преломляющейсилы глаза1. Из-за своей значительной роли в зрении травмы роговицы и помутнение кожи вызывают значительное ухудшение зрения и являются второй по значимости причиной предотвратимой слепоты во всем мире 2,3. При повреждениях роговицы с тяжелой лимбальной дисфункцией барьерная функция лимба снижается, что приводит к миграции клеток конъюнктивы к поверхности роговицы и конъюнктивализации роговицы 4,5, что резко ухудшает зрение. В связи с этим для решения проблемы глобального бремени слепоты роговицы и связанной с ней инвалидности необходимы эффективные профилактические и терапевтические стратегии.
Современное понимание процесса заживления ран роговицы человека основано на предыдущих исследованиях, в которых изучалась реакция роговицы на различные травмы. Для индуцирования различных химических или механических повреждений роговицы 6,7,8,9 и для исследования различных аспектов процесса заживления ран роговицы было использовано несколько методов и моделей на животных.
Модель ожога щелочью представляет собой хорошо зарекомендовавшую себя модель травмы, которая выполняется путем нанесения гидроксида натрия (NaOH) непосредственно на поверхность роговицы или с помощью плоской фильтровальной бумаги10. Щелочное повреждение приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов и инфильтрации полиморфноядерных клеток не только в роговице и передней камере глаза, но и в сетчатке. Это индуцирует непреднамеренный апоптоз ганглиозных клеток сетчатки и активацию CD45+ клеток11. Поэтому очень важно точно локализовать место повреждения, чтобы избежать чрезмерного непреднамеренного травмирования с помощью модели щелочного повреждения.
Осевая длина глазного яблока мыши составляет примерно 3 мм12. Из-за такого короткого расстояния между роговицей и сетчаткой существует крутая кривизна роговицы, обеспечивающая высокую преломляющую силу для фокусировки света на сетчатке (рис. 1A). Какмы сообщали ранее, вызвать химическое повреждение этой сильно изогнутой поверхности с помощью плоской фильтровальной бумаги сложно, особенно в лимбе (рис. 1B). Чтобы вызвать повреждение лимба, необходимо наклонить фильтровальную бумагу, что может привести к непреднамеренному повреждению свода и прилегающей конъюнктивы14. Другой подход заключается в непосредственном нанесении химического агента в виде капель на поверхность роговицы. Однако этот метод не контролирует время воздействия, и существует потенциальный риск вызвать травму конъюнктивы, свода и век из-за диффузии жидкости в эти области.
Чтобы преодолеть эти ограничения, в данном исследовании представлен новый метод удара-трепана, вызывающий травму. Этот метод имеет ряд преимуществ, в том числе (i) индуцирование эффективного химического повреждения всей поверхности роговицы и лимба в мышиной модели, (ii) индуцирование локализованного и четко очерченного повреждения роговицы, (iii) возможность применения любой интересующей жидкости в течение заранее определенного времени, и (iv) способность вызывать различные размеры повреждений роговицы путем выбора соответствующих биопсийных пуансонов. Этот метод также применим для моделей травм крыс и кроликов, которые также демонстрируют изогнутую поверхность роговицы и являются распространенными животными моделями, используемыми для изучения заживления ран на поверхности глаза.
Все процедуры проводились в соответствии со Стэнфордским соглашением по уходу за лабораторными животными APLAC No 33420, использованием животных в научных целях, а также Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. В общей сложности 10 самцов и самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель были щедро предоставлены лабораторией Ирвинга Л. Вайсмана. Животные были акклиматизированы к 12-часовому циклу «свет-темнота» и обеспечены водой и кормом вволю. Животное получило травму одного глаза.
1. Подготовка к эксперименту
2. Подготовка животных
3. Индукция щелочного повреждения
4. Клиническая оценка
5. Энуклеация
6. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и периодическим кислотным окрашиванием по Шиффу (PAS)
7. Иммунофлуоресцентная визуализация и анализ
Эффективность метода в индуцировании дефицита лимбальных стволовых клеток (ЛСКД) оценивали путем оценки клинико-гистологических признаков ЛСКД. Клиническую оценку проводили с помощью щелевой микроскопии и оптической когерентной томографии переднего сегмента (АС-ОКТ) (рис. 3 и рис. 4).
Реэпителизация происходила центростремительно и происходила быстрее в височной части роговицы по сравнению с ее носовой частью. У поврежденных глаз сразу после химического поражения развилась мутность роговицы 2+-3+ (рис. 3). Эпителиальные клетки мигрировали из конъюнктивы на поверхность роговицы после травмы лимба. Большой дефект эпителия роговицы был полностью реэпителизирован на 12-14-е сутки, что заняло больше времени по сравнению с повреждением эпителия роговицы аналогичного размера и неповрежденной базальной мембраны и стромы, которое обычно заживало в течение 5 дней после травмы 8,9. Из-за LSCD у 50% поврежденных глаз к концу второй недели развились стойкие дефекты эпителия (рис. 3). Отек роговицы был более выраженным в течение первых нескольких дней (рис. 3, рис. 4), в то время как фиброз роговицы был значительным на второй неделе, что привело к помутнению роговицы 4+ у 100% поврежденных глаз.
Ранние признаки неоваскуляризации (НВ) наблюдались клинически и гистологически через 24 ч после индукции химического повреждения, как показано на рисунке 5, что согласуется с хронологической шкалой НВ, выявленной в исследовании Kvanta et al., которое показало признаки лимбального НВ через 24 ч после травмы22. В процессе заживления созревали новые сосуды и к 14-му дню после травмы НВ пересекал лимб и достигал центральной роговицы. Лимб, определяющий границу между конъюнктивой и роговицей, был разрушен.
Гистологические признаки дефицита лимбальных стволовых клеток и конъюнктивализации наблюдались по появлению бокаловидных клеток PAS+ и стромальных кровеносных сосудов 23,24,25,26. Бокаловидные клетки наблюдались в данной модели травмы и обозначены стрелкой на рисунке 6.
Эпителий конъюнктивы и роговицы в основном экспрессируют уникальные кератины К13 и К12 соответственно27. После лимбальной травмы новые эпителиальные клетки, происходящие из конъюнктивы, покрывали оголенную роговицу, и K12 не экспрессировался на поверхности роговицы ни одного травмированного животного в течение 2 недель после травмы. Этот результат, согласующийся с другими исследованиями28, указывал на полную ЛСКД и отсутствие эпителиальных клеток роговицы на поверхности роговицы. Тем не менее, в исследовании Park et al.29 они обнаружили экспрессию K12 через 20 и 32 недели после травмы, что позволяет предположить возможную трансдифференцировку эпителиальных клеток.
Следовательно, мы наблюдали, что химическое повреждение разрушало лимб и лимбальные стволовые клетки, что приводило к миграции эпителиальных клеток конъюнктивы в центр роговицы, чтобы покрыть оголенную поверхность роговицы. Это подтверждается маркером клеток эпителия конъюнктивы K13, который экспрессировался по всей поверхности конъюнктивы и роговицы, как показано на рисунке 7.
Рисунок 1: Нормальный правый глаз мыши и пунш-трепан для индуцирования повреждения роговицы и лимбов. (A) Вид сбоку, показывающий глаз мыши с сильно изогнутой роговицей (стрелки указывают на лимб). (Б) На рисунке видно, что даже большой фильтровальной бумаги недостаточно для того, чтобы адекватно покрыть лимбальную область. Диаметр глаза мыши от лимба до лимба составляет почти 4 мм, а пункционная биопсия с наружным диаметром 4,5 мм и внутренним диаметром 3,5 мм (панели D и H) соответствующим образом покрывает поверхность роговицы и лимбальной поверхности, как показано на панелях (C) и (E). (F) Пунш-трепан надлежащим образом удерживается над земным шаром вокруг лимбальной области. (G) Чтобы гарантировать отсутствие утечки через край пуансона-трепана, после соответствующего позиционирования пуансона-трепина на параллельной оси с глобусом, отверстие заполняется метиленовым синим. Утечки метиленового синего не обнаружено. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Энуклеированные глаза. (А) Глаза были энуклеированы с сохранением бульбарной и пальпебральной конъюнктивы, слезной железы (наконечник стрелы) и зрительного нерва (стрелка). Нормальные (В) и поврежденные (С) глаза насыщали 30% сахарозой для защиты от образования криокристаллов. Носовая часть земного шара узнаваема через носовой карункул (обозначен буквой N). Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Заживление раны левого глаза. Процесс заживления раны левого глаза мыши в течение 2 недель после повреждения роговицы и лимбальной щелочи на мышиной модели показан здесь (A-F). Осмотр глаза с помощью щелевой лампы. Отек роговицы более выражен на 0-й и 2-й дни (A, B), тогда как фиброз более заметен на второй неделе после травмы (E-F). A.f-F.f показывают процесс реэпителизации одного и того же глаза. Тотальный дефект эпителия роговицы и лимба непосредственно после индукции травмы наблюдается при А.Ф. Дефект эпителия заживает миграцией клеток эпителия конъюнктивы по центростремительному типу к 12-14 суткам (А.ф-Ф.ф.). Тем не менее, у 50% поврежденных глаз развился стойкий дефект эпителия в конце второй недели, как показано стрелкой на изображениях F и F.f. Масштабная линейка = 1 мм (панель C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: ОКТ переднего сегмента глаза мыши. (A) АС-ОКТ иллюстрирует нормальное искривление роговицы и передней камеры. Структура радужной оболочки хорошо выражена и узнаваема. Иридокорнеальная адгезия не обнаруживается на средней периферии радужной оболочки. (Б) Сразу после травмы толщина роговицы увеличивается из-за образования отека, и на средней периферии радужки развивается иридокорнеальная адгезия. (В) Через две недели после травмы кривизна роговицы изменилась, и видна полная иридокорнеальная адгезия с разрушением передней камеры. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Неоваскуляризация роговицы. Клинико-гистологические признаки неоваскуляризации роговицы могут наблюдаться в процессе заживления раны после повреждения гидроксидом натрия (NaOH). (А) Начальные признаки неоваскуляризации обнаруживаются в первые сутки после травмы и характеризуются красноватым обесцвечиванием роговицы (обозначено белой стрелкой). Это изменение цвета является результатом скопления эритроцитов в строме, как показано на соответствующем гистологическом изображении (D) (отмечено желтыми стрелками). (Б) В течение первой недели регенерации новые сосуды постепенно увеличиваются и распространяются по всей роговице. (В) К концу 2 недель лимбальная область разрушается, и новые сосуды продолжают развиваться. (E) Гистологический разрез роговицы дополнительно иллюстрирует наличие глубокой стромальной неоваскуляризации (показано наконечниками стрелок). Щелевая лампа Масштабная линейка изображения = 1 мм, масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Периодическое кислотно-шиффовское и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание роговицы. Периодическое кислотно-шиффовское и иммуногистохимическое окрашивание нормальной и поврежденной роговицы проводили через 2 недели после травмы. Нормальный эпителий роговицы мыши, состоящий из 4-5 слоев клеток (А). Щелочное повреждение роговицы и лимба приводило к конъюнктивализации роговицы с появлением бокаловидных клеток на поверхности роговицы, как показано черными стрелками на рисунке (D). Нормальные эпителиальные клетки роговицы экспрессируют K12 (B), который не экспрессируется конъюнктивальными клетками, покрывающими поврежденную роговицу (E). К13, характерный маркер эпителиальных клеток конъюнктивы, не экспрессируется на нормальных эпителиальных клетках роговицы (С). Однако он присутствует на поврежденной поверхности роговицы гидроксидом натрия (NaOH), что является признаком конъюнктивализации роговицы (F). Масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм, масштабная линейка окрашенного ИГХ изображения = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Гематоксилин и эозин и иммуногистохимическое окрашивание. Проводили гематоксилин и эозин (H&E) и иммуногистохимическое окрашивание нормальной и поврежденной ткани лимба. (А) Нормальный лимб отмечает переходную область между концом склеры и началом роговицы. Эта область обычно покрыта одним или двумя слоями эпителиальных клеток конъюнктивы (обозначены стрелками). В здоровом глазу экспрессия специфического эпителиального маркера роговицы, называемого K12, начинается в лимбе и распространяется на поверхность роговицы (показано на рисунке B). С другой стороны, экспрессия конъюнктивального маркера, известного как K13, ограничена лимбом и не выходит за его пределы (обозначена белой стрелкой на рисунке C). В глазах, поврежденных гидроксидом натрия (NaOH), нарушаются границы лимба. Это приводит к миграции клеток конъюнктивы в сторону поврежденной роговицы. (D) Изображения лимба, поврежденного NaOH, демонстрируют наличие неоваскуляризации как под эпителиальным слоем, так и в стромальной ткани. После травмы на поврежденной поверхности роговицы отсутствует присутствие K12 (E), в то время как K13 обильно экспрессируется на поверхности роговицы (F). Масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм, масштабная линейка окрашенного ИГХ изображения = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Протокол окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Видео 1: Повреждение роговицы и лимба NaOH на мышиной модели с помощью панч-трепана. На видео демонстрируется процедура индуцирования NaOH повреждения роговицы и лимба на мышиной модели с помощью пунша-трепана. Очень важно держать пунш-трепан параллельно земному шару и оказывать минимальное давление на лимб. Эта правильная техника необходима для предотвращения протечек и достижения оптимальных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 2: Иллюстрация техники энуклеации с сохранением бульбарной конъюнктивы. Чтобы отличить носовую сторону земного шара от височной стороны, носовой карункул сохраняют вместе с глобусом. Рассекается вся конъюнктива, начиная от ее соединения с тарзальной пластинкой. При минимальном давлении орбитальное содержимое выпячивается наружу. Направляя щипцы к задней части шара, зрительный нерв захватывается, и ткань извлекается. Энуклеированная ткань включает в себя глобус, орбитальный жир и слезную железу орбиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
В этом исследовании предлагается инновационное устройство, панч-трепан, которое может быть использовано для успешного индуцирования эффективного и воспроизводимого повреждения роговицы и лимба на мышиной модели. Эта модель дефицита лимбальных стволовых клеток идеально подходит для изучения динамики заживления ран роговицы и конъюнктивализации после травмы.
Фактические данные свидетельствуют о том, что как лимбальная ниша, так и центральная часть роговицы мыши содержат стволовые клетки30. Таким образом, для создания модели дефицита стволовых клеток требуется эффективное повреждение роговицы и лимбальной области, а представленная здесь модель повреждения позволяет подвергать искривленный лимб роговицы воздействию химического агента в течение определенного периода времени. Для определения наилучшей концентрации и продолжительности повреждения NaOH травмы наносили с различными концентрациями и продолжительностью NaOH. Более высокие концентрации NaOH или более длительная продолжительность воздействия приводили к усилению повреждения тканей и фиброзу. Таким образом, исследователи могут корректировать эти параметры в зависимости от конкретных целей своего исследования и желаемой тяжести травмы.
Для успешного воспроизведения этой модели повреждения роговицы и лимба необходимо учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо измерить лимбальный диаметр целевого глаза, чтобы определить подходящий размер пуансона. Рекомендуется выбрать биопсийный пуансон с наружным диаметром, который на 0,5 - 1 мм больше этого диаметра.
Поверхностное натяжение используемой жидкости является важным фактором предотвращения утечки на границе раздела между поверхностью глаза и краем трепана, как показано на рисунке 1G. Поэтому нет необходимости оказывать давление на кончик пункционной биопсии.
Чтобы избежать нанесения механических повреждений тканям, критически важно держать пуансон трепан параллельно оси с глазом и воздерживаться от давления на лимб. Неправильная регулировка оси трепана пуансона может увеличить риск утечки и привести к децентрированному месту травмы и неточным результатам.
Некоторые потенциальные ограничения этой техники включают в себя необходимость выбора подходящего размера пуансона, приобретение навыков удержания трепана пуансона и потенциальный риск причинения механических травм. Однако эти ограничения можно преодолеть на практике и следуя инструкциям, изложенным в этом протоколе. Штамм и возрастной диапазон мышей являются другими факторами, влияющими на процесс реэпителизации, и должны быть учтены в исследовании.
Кроме того, преимущество предлагаемого протокола заключается в том, что в нем подробно описан метод энуклеации, который сохраняет бульбарную и пальпебральную конъюнктиву и позволяет определить носовую часть земного шара без наложения хирургических швов в качестве маркера. Предыдущие исследования показали, что носовая область глаза обладает самой низкой нервной иннервацией по сравнению с другими областями роговицы, что делает ее более уязвимой к неоваскуляризации и снижению регенеративной эффективности31,32.
Таким образом, клинические признаки LSCD, такие как помутнение роговицы (CO), стойкие дефекты эпителия и неоваскуляризация роговицы (NV), наряду с наблюдаемыми гистологическими изменениями, включая метаплазию бокаловидных клеток, экспрессию K13 на поверхности роговицы и отсутствие K12 на поверхности роговицы, подтверждают наличие LSCD в этой модели. Эти результаты свидетельствуют о том, что этот новый метод эффективен в индуцировании LSCD. Эта модель химического повреждения может быть использована в доклинических исследованиях для изучения новых лекарств и фармацевтических методов лечения в области повреждения и регенерации роговицы.
Мы признаем, что NEI P30-EY026877 поддерживает это исследование. Мы выражаем глубокую признательность Шарлин Вонг и лаборатории доктора Ирва Вайсмана в Институте биологии стволовых клеток и регенеративной медицины Стэнфордского университета за их любезную помощь в предоставлении экспериментальных животных. Мы благодарим Хирада Резаипура за помощь в подготовке и редактировании изображений.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved