Выделение и идентификация клеток лимбальных ниш

Summary

Здесь мы представляем протокол для выделения и идентификации клеток лимбальной ниши человека.

Abstract

Здесь мы сообщаем о стандартной процедуре выделения и идентификации клеток лимбальной ниши (LNCs). Ткань лимбуса, полученная из глазного банка, использовалась для выделения LNCs. Ткань делили на 12 частей в асептических условиях и переваривали в течение 18 ч при 37 °С в инкубаторе клеточных культур с использованием коллагеназы А для получения клеточных кластеров с LNC и клетками-предшественниками лимбального эпителия. Клеточные кластеры дополнительно расщепляли в течение 15 мин при 37 °C с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА для получения единичных клеток, а затем культивировали в модифицированной среде эмбриональных стволовых клеток (MESCM) на пластиковой поверхности, покрытой 5% Матригелем. Клетки пассажировали при слиянии 70%, а LNC идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции, количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) и проточной цитометрии. Первичные ЛНК были изолированы и пассированы более 12 раз. Пролиферационная активность ЛНК от Р4 до Р6 была самой высокой. LNC экспрессировали более высокие маркеры стволовых клеток, чем BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR и PDGFRβ). Кроме того, результаты показали, что P4 LNC равномерно экспрессируют VIM, CD90, CD105 и PDGFRβ, но не Pan-CK, который может быть использован в качестве маркера для идентификации LNC. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 95%, 97%, 92% и 11% LNC экспрессировали CD73, CD90, CD105 и SCF соответственно, в то время как в BMMSC они составляли 68%, 99%, 20% и 3%. Стандартный процесс выделения и идентификации LNC может обеспечить надежную лабораторную основу для широкого использования LNC.

Introduction

Заболеваемость дефицитом эпителиальных стволовых клеток роговицы (CESD), также называемая дефицитом лимбальных стволовых клеток (LSCD)¹, и регенерация эпителия роговицы (CES) становятся все более и более актуальными из-за инфекции и травмы роговицы. При отсутствии надлежащего лечения CESD может привести к слепоте, которая требует пересадки роговицы. В результате, регенерация CES становится все более значимой. Существует группа поддерживающих клеток, называемых клетками лимбальной ниши (LNC), которые обеспечивают необходимую поддержку функции CES. Лимбальные стромальные стволовые клетки были впервые выделены Polisetty et ^al.2

Protocol

Ткань лимбуса от доноров в возрасте от 50 до 60 лет была получена из Глазного банка Красного Креста, больница Тунцзи (Ухань, Китай). Протокол был одобрен Комитетом по этике Тунцзи и проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Изоляция

1. Получение тка.......

Discussion

Прозрачность роговицы обычно поддерживается за счет регулярного расположения и распределения мелких волокон (25-30 нм в диаметре) в строме роговицы, что имеет решающее значение для нормальной остроты зрения¹⁶. В мире насчитывается 253 миллиона людей с нарушениями зрения, 36 мил.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100