J.L.M., UTS Şansölyesi Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.

NOT: Deney tasarımı, numune toplama ve saklama 2,30,31 başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yabani mercanların toplanması için izin onayı, toplama ve deneyden önce alınmalıdır. Buradaki örnekler, Batavia Mercan Çiftlikleri'nden (Geraldton, WA) ithal edilen Montipora mollis (yeşil renk morfu) kolonilerinden toplanmıştır ve orijinal olarak Abrohlos Adaları açıklarındaki bir resiften...

GC-MS Kullanılarak Sert Mercan Örneklerinin Metabolit Profillemesi

Konakçı ve simbiyotun ayrılması, basit santrifüjleme yoluyla kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve buradaki sonuçlar, fraksiyonların ayrılmasının, mercan sağlığının fonksiyonel analizine katkıda bulunabilecek spesifik holobiont üye katkılarının göstergesi olan değerli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Yetişkin mercanlarda, lipid sentezi esas olarak lipitler (örneğin, triaçilgliserol ve fosfolipitler)41 ve stres iyileşmesini teşvik edebilen yağ asitleri<sup clas...

Metabolitler, hücresel süreçlerin son ürünlerini temsil eder ve metabolomikler - belirli bir organizma veya ekosistem tarafından üretilen metabolitler paketinin incelenmesi - organizma işleyişinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayabilir1. Bu, ekosistemleri, simbiyotik etkileşimleri ve restorasyon araçlarını keşfetmek için özellikle kritiktir, çünkü çoğu yönetim stratejisinin amacı belirli ekosistem hizmet işlevlerini korumak (veya geri yüklemek)2. Mercan resifleri, simbiyotik etkileşimleri aydınlatmak ve mercan fizyolojik tepkilerini topluluk düzeyinde ve ekosistem düzeyinde etkilere bağlamak için metabolomiklerin potansiyel değerini gösteren bir su ekosistemidir3. Yüksek verimli gaz kromatografisi-kütle spektrometrisinin (GC-MS) uygulanması, yüksek seçicilik ve hassasiyetle aynı anda çok çeşitli metabolit sınıflarını hızlı bir şekilde analiz etme, spektral kitaplıklar mevcut olduğunda hızlı bileşik tanımlaması sağlama ve numune başına nispeten düşük bir maliyetle yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlama kapasitesi nedeniyle özellikle değerlidir.
Mercanlar, mercan hayvanı, fotosentetik dinoflagellat endosimbiyontlar (aile: Symbiodiniaceae4) ve karmaşık bir mikrobiyom 5,6'dan oluşan holobiontlardır. Genel olarak, holobiontun uygunluğu, öncelikle her bir üyeninmetabolik işleyişini desteklemek için küçük moleküllerin ve elementlerin değiş tokuşu yoluyla korunur 7,8,9,10. Metabolomik yaklaşımların, simbiyoz özgüllüğününmetabolik temelini aydınlatmak için özellikle güçlü olduğu kanıtlanmıştır 9,11, termal strese ağartma tepkisi 7,8,12,13, hastalık tepkileri 14, kirliliğe maruz kalma tepkileri 15, fotoiklimlendirme 16 ve kimyasal sinyalleşme 17 mercanlarda ve ayrıca biyobelirteç keşfine yardımcı olmak 18,19. Ek olarak, metabolomikler, DNA ve RNA tabanlı tekniklerdençıkarılan sonuçların değerli bir şekilde doğrulanmasını sağlayabilir 9,20. Bu nedenle, resif sağlığını değerlendirmek ve resiflerin korunması için araçlar geliştirmek için metabolomiklerinkullanımı için önemli bir potansiyel vardır 3, örneğin stresin metabolik biyobelirteçlerininsaptanması 18,19 ve beslenme sübvansiyonları gibi aktif yönetim stratejilerinin potansiyelini incelemek için21.
Konakçı ve simbiyont hücreleri ayırmak ve metabolit profillerini holobiont olarak birlikte değil, bağımsız olarak analiz etmek, partner etkileşimleri, bağımsız fizyolojik ve metabolik durumlar ve adaptasyon için potansiyel moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi verebilir 11,12,22,23,24. Mercan ve Symbiodiniaceae'yi ayırmadan, karmaşık genom rekonstrüksiyonu ve metabolik modelleme25 dışında, mercan ve/veya Symbiodiniaceae'nin katkısını ve metabolizmasını bağımsız olarak aydınlatmak neredeyse imkansızdır, ancak bu henüz mercan-dinoflagellat simbiyozuna uygulanmamıştır. Ayrıca, konakçının veya alg simbiyontunun bireysel metabolizması hakkında holobiontun metabolit profilinden bilgi çıkarmaya çalışmak yanlış yorumlamaya yol açabilir.
Örneğin, yakın zamana kadar, mercan ve holobiont dokularından elde edilen ekstraktlarda C18: 3n-6, C18: 4n-3 ve C16 çoklu doymamış yağ asitlerinin varlığının, mercanların omega-3 (ω3) yağ asitlerinin üretimi için gerekli olan ωx desatürazlara sahip olmadığı varsayıldığından, alg simbiyontundan türetildiği düşünülüyordu; bununla birlikte, son genomik kanıtlar, çoklu cnidarian'ın ω3 PUFA de novo üretme ve daha fazla biyosentez yapma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.3 uzun zincirli PUFA26. GC-MS'nin kararlı izotopik etiketleme (örneğin, 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) ile birleştirilmesi, hem kontrol koşulları altında hem de dış stres faktörlerine yanıt olarak mercan holobiont metabolik ağları yoluyla fotosentetik olarak sabitlenmiş karbonun kaderini izlemek için kullanılabilir27,28. Bununla birlikte, 13 ° C'nin kaderinin izlenmesinde kritik bir adım, mercan dokusunun alg hücrelerinden ayrılmasıdır - ancak o zaman mercan konakçı fraksiyonunda 13C etiketli bir bileşiğin varlığı, mercana translokasyonlu bir Symbiodiniaceae türevi metabolit veya translokasyonlu etiketli bir bileşiğin aşağı akış ürünü olarak kesin olarak atanabilir. Bu teknik, gliserolün, fotosentezin ortakyaşamdan konakçıya29 yer değiştirdiği birincil form olduğu varsayımına meydan okuyarak ve ayrıca ağartma27,28 sırasında ve uyumsuz Symbiodiniaceae türlerine yanıt olarak eşler arası beslenme akışının nasıl değiştiğini açıklayarak gücünü göstermiştir11.
Dokuları ayırma kararı öncelikle araştırma sorusu tarafından yönlendirilirken, bu yaklaşımın pratikliği, güvenilirliği ve potansiyel metabolik etkilerinin dikkate alınması önemlidir. Burada, holobionttan metabolitlerin yanı sıra ayrı konakçı ve simbiyont fraksiyonlarından ekstraksiyonu için ayrıntılı, kanıtlanmış yöntemler sunuyoruz. Konak ve simbiyotun metabolit profillerini bağımsız olarak karşılaştırıyoruz ve bu profillerin holobiont metabolit profiliyle nasıl karşılaştırıldığını karşılaştırıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% LC-grade methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>439193</td>
			<td>LC grade essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes, PP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121880</td>
			<td>Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2030 Shimadzu gas chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>GC-2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710-1180 &#181;m acid-washed glass beads</td>
			<td>Merck</td>
			<td> 
			G1152</td>
			<td>This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>AOC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Any protein colourimetric reagent is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air gun</td>
			<td>Ozito</td>
			<td>6270636</td>
			<td>Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 &#181;m film thickness</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>RTC000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5&#8211;15N Valine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>605514/ 600148</td>
			<td>Either or both internal standards can be added to the methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials</td>
			<td>Merck</td>
			<td>V7130</td>
			<td>20 mL, with non-plastic seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglogin G</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56834</td>
			<td>if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td></td>
			<td>v4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>v4.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LabSolutions Insight software</td>
			<td></td>
			<td>v3.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Pellets to make 1 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tidyverse</td>
			<td></td>
			<td>v1.3.1</td>
			<td>R package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85600</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>GCMS-TQ8050 NX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-96 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M3812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whirl-Pak sample bag</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WPB01018WA</td>
			<td>Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gas chromatography-mass spectrometry-based targeted metabolomics of hard coral samples

Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) tabanlı yaklaşımların, cnidarian-dinoflagellat simbiyozunun metabolik temelini ve mercanın strese nasıl tepki verdiğini (yani, sıcaklığa bağlı ağartma sırasında) aydınlatmak için güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Cnidarian konakçısını ve onunla ilişkili mikropları (Symbiodiniaceae ve diğer protistler, bakteriler, arkeler, mantarlar ve virüsler) içeren mercan holobiontunun kararlı durum metabolit profili, mercanın bütünsel metabolik durumunu karakterize etmek için ortam ve stres koşulları altında başarıyla uygulanmıştır.
Bununla birlikte, simbiyotik etkileşimleri çevreleyen soruları cevaplamak için, mercan konakçısının ve alg simbiyontlarının metabolit profillerini bağımsız olarak analiz etmek gerekir, bu da yalnızca dokuların fiziksel olarak ayrılması ve izolasyonu ile elde edilebilir, ardından bağımsız ekstraksiyon ve analiz ile elde edilebilir. Metabolomiklerin uygulanması mercan alanı için nispeten yeni olsa da, araştırma gruplarının sürekli çabaları, mercan konakçı dokusunun ve alg simbiyontlarının ayrılması da dahil olmak üzere mercanlardaki metabolitleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır.
Bu makale, dikkate alınması gereken temel optimizasyon adımları da dahil olmak üzere, GC-MS analizi için holobiont ayrımı ve metabolitlerin ekstraksiyonu için adım adım bir kılavuz sunmaktadır. Bağımsız olarak analiz edildikten sonra, iki fraksiyonun (mercan ve Symbiodiniaceae) birleşik metabolit profilinin bütünün profiline (holobiont) nasıl benzer olduğunu gösteriyoruz, ancak dokuları ayırarak, iki ortağın metabolizması ve etkileşimleri hakkında tek başına bütünden elde edilemeyen önemli bilgiler de elde edebiliriz.

Metabolites represent the end products of cellular processes, and metabolomics - the study of the suite of metabolites produced by a given organism or ecosystem - can provide a direct measure of organismal functioning1. This is particularly critical for exploring ecosystems, symbiotic interactions, and restoration tools, as the goal of most management strategies is to preserve (or restore) specific ecosystem service functions2. Coral reefs are one aquatic ecosystem that demonstrates the potential value of metabolomics for elucidating symbiotic interactions and linking coral physiological responses to community-level and ecosystem-level impacts3. The application of high-throughput gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) is especially valued due to its capacity to rapidly analyze a broad range of metabolite classes simultaneously with high selectivity and sensitivity, provide rapid compound identification when spectral libraries are available, and provide a high level of reproducibility and accuracy, with a relatively low cost per sample.
Corals are holobionts consisting of the coral animal, photosynthetic dinoflagellate endosymbionts (family: Symbiodiniaceae4), and a complex microbiome5,6. Overall, the fitness of the holobiont is maintained primarily through the exchange of small molecules and elements to support the metabolic functioning of each member7,8,9,10. Metabolomic approaches have proven especially powerful for elucidating the metabolic basis of symbiosis specificity9,11, the bleaching response to thermal stress7,8,12,13, disease responses14, pollution exposure responses15, photoacclimation16, and chemical signalling17 in corals, as well as aiding in biomarker discovery18,19. Additionally, metabolomics can provide valuable confirmation of the conclusions inferred from DNA- and RNA-based techniques9,20. There is, therefore, considerable potential for the use of metabolomics for assessing reef health and developing tools for reef conservation3, such as through the detection of metabolic biomarkers of stress18,19 and for examining the potential of active management strategies such as nutritional subsidies21.
Separating the host and symbiont cells and analyzing their metabolite profiles independently, rather than together as the holobiont, can yield more information about the partner interactions, independent physiological and metabolic statuses, and potential molecular mechanisms for adaptation11,12,22,23,24. Without separating the coral and Symbiodiniaceae, it is almost impossible to elucidate the contribution and metabolism of coral and/or Symbiodiniaceae independently, except for with complex genome reconstruction and metabolic modeling25, but this has yet to be applied to the coral-dinoflagellate symbiosis. Furthermore, attempting to extract information about the individual metabolism of the host or algal symbiont from the metabolite profile of the holobiont can lead to misinterpretation.
For example, until recently, the presence of C18:3n-6, C18:4n-3, and C16 polyunsaturated fatty acids in extracts from coral and holobiont tissues was thought to be derived from the algal symbiont, as corals were assumed to not possess the &#969;x desaturases essential for the production of omega-3 (&#969;3) fatty acids; however, recent genomic evidence suggests that multiple cnidarians have the ability to produce &#969;3 PUFA de novo and further biosynthesize &#969;3 long-chain PUFA26. Combining GC-MS with stable isotopic labeling (e.g., 13C-bicarbonate, NaH13CO3) can be used to track the fate of photosynthetically fixed carbon through coral holobiont metabolic networks under both control conditions and in response to external stressors27,28. However, a critical step in the tracking of 13C fate is the separation of the coral tissue from the algal cells-only then can the presence of a 13C-labeled compound in the coral host fraction be unequivocally assigned as a Symbiodiniaceae-derived metabolite translocated to the coral or a downstream product of a translocated labeled compound. This technique has demonstrated its power by challenging the long-held assumption that glycerol is the primary form in which photosynthate is translocated from symbiont to host29, as well as elucidating how inter-partner nutritional flux changes during bleaching27,28 and in response to incompatible Symbiodiniaceae species11.
While the decision to separate tissues is primarily driven by the research question, the practicality, reliability, and potential metabolic impacts of this approach are important to consider. Here, we provide detailed, demonstrated methods for the extraction of metabolites from the holobiont, as well as the separate host and symbiont fractions. We compare the metabolite profiles of the host and symbiont independently and how these profiles compare to the holobiont metabolite profile.

Yazar Spotlight: Mercan Konak Dokularının ve Alg Simbiyotlarının Ayrılması ve Metabolitlerinin Analiz Edilmesi 

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Sert Mercan Örneklerinin Hedefli Metabolomikleri

As with every organism, corals depend on superlative nutrition to grow and construct reefs for immunity and reproduction and to withstand changing environmental conditions. But we know very little about optimal nutrition for corals under normal or changing conditions, and how each member of the coral holobiont contributes to this nutritional status. Corals are holobionts comprised of the host and various symbiotic microorganisms.These include Symbiodiniaceae, protists, bacteria, viruses, and fungi. The fitness of the holobiont depends on the metabolic interactions between these members. For instance, Symbiodiniaceae provide photosynthate to support the host's metabolism and help it adapt to changing conditions.To understand this crucial partnership, we need to study each partner's chemical and metabolic composition separately. These findings demonstrated that more information could be obtained by separating host and symbiont fractions for metabolic analysis. However, the decision to analyze separate fractions versus the holobiont is ultimately governed by the research question.So in cases where analysis of the holobiont is preferable, we provided a methodology for holobiont metabolite extractions, and suggestions to obtain as much information as possible during analysis. The methods used in this study open up new avenues for research. These include revealing potential biomarkers, identifying key metabolites during specific life stages or stress conditions, understanding the advantages of associating with certain species, and exploring interactions within the holobiont.Future research will focus on applying the protocols established here to several research areas, including the detection of biomarkers with applications in coral reef conservation and restoration. This methodology can also be applied where the separation of fractions isn't possible for other physiological measures. For example, when analyzing volatile metabolite emissions from coral colonies.

Bu çalışma sırasında üretilen tüm veriler ek bilgilerde mevcuttur.
Konak-simbiyont ayrımı
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Şekil 1: Mercan konakçı dokularının ve Symbiodiniaceae hücrelerinin ayrılmasının kurulumu ve doğrulanması. (A) Mercan dokusunun mercan iskeletinden ç?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Coral Host Tissues and Algal Symbionts and Analyzing Their Metabolites at JoVE.com

Burada, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi analizi için bir mercan holobiontundan polar ve yarı polar metabolitlerin yanı sıra ayrılmış mercan konakçı dokusu ve Symbiodiniaceae hücre fraksiyonlarının ekstraksiyonunu ve hazırlanmasını sunuyoruz.

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Her organizmada olduğu gibi, mercanlar da bağışıklık ve üreme için resifler yetiştirmek ve inşa etmek ve değişen çevresel koşullara dayanmak için üstün beslenmeye bağlıdır. Ancak, normal veya değişen koşullar altında mercanlar için en uygun beslenme ve mercan holobiontunun her bir üyesinin bu beslenme durumuna nasıl katkıda bulunduğu hakkında çok az şey biliyoruz. Mercanlar, konakçı ve çeşitli simbiyotik mikroorganizmalardan oluşan holobiontlardır.Bunlara Symbiodiniaceae, protistler, bakteriler, virüsler ve mantarlar dahildir. Holobiont'un uygunluğu, bu üyeler arasındaki metabolik etkileşimlere bağlıdır. Örneğin, Symbiodiniaceae, konakçının metabolizmasını desteklemek ve değişen koşullara uyum sağlamasına yardımcı olmak için fotosentez sağlar.Bu önemli ortaklığı anlamak için, her ortağın kimyasal ve metabolik bileşimini ayrı ayrı incelememiz gerekir. Bu bulgular, metabolik analiz için konakçı ve simbiyont fraksiyonlarının ayrılmasıyla daha fazla bilgi elde edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, holobiont'a karşı ayrı kesirleri analiz etme kararı, nihayetinde araştırma sorusu tarafından yönetilir.Bu nedenle, holobiont analizinin tercih edildiği durumlarda, holobiont metabolit ekstraksiyonları için bir metodoloji ve analiz sırasında mümkün olduğunca fazla bilgi elde etmek için öneriler sağladık. Bu çalışmada kullanılan yöntemler araştırma için yeni yollar açmaktadır. Bunlar, potansiyel biyobelirteçleri ortaya çıkarmayı, belirli yaşam evreleri veya stres koşulları sırasında temel metabolitleri tanımlamayı, belirli türlerle ilişkilendirmenin avantajlarını anlamayı ve holobiont içindeki etkileşimleri keşfetmeyi içerir.Gelecekteki araştırmalar, burada oluşturulan protokollerin, mercan resiflerinin korunması ve restorasyonundaki uygulamalarla biyobelirteçlerin tespiti de dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarına uygulanmasına odaklanacaktır. Bu metodoloji, diğer fizyolojik önlemler için fraksiyonların ayrılmasının mümkün olmadığı durumlarda da uygulanabilir. Örneğin, mercan kolonilerinden uçucu metabolit emisyonlarını analiz ederken.

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Sert Mercan Örneklerinin Hedefli Metabolomikleri

Abstract