מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).

1. הכנה
<ol><li>טיפול לדוגמה<ol><li>בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.</li>
		<li>הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).</li>
		<li>להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.</li>
		<li>צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופ?...

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16<sup class="x...

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים5. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)6. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים 7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב10.
בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.
כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

Author Spotlight: Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus  

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.
לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. ה...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus at JoVE.com

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

המחקר שלנו עוסק בעיקר בטיהור אנזים פיברינוליטי. עבודה זו מנסה להקים שיטת טיהור פשוטה עבור אנזים פיברינוליטי. בעבודה זו, אנו מדווחים לראשונה על מערכת טיהור ארגינין או ליזין בעלת הזיקה הטובה ביותר של אנזים פיברינוליטי.בהשוואה לשיטות הטיהור הקונבנציונליות, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus. לפיתוח פרוטוקול זה יש משמעות רבה יותר לניצול נוסף של אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus וחומרים דומים אחרים.