Аффинная очистка фибринолитического фермента из Sipunculus nudus

Summary

Здесь мы представляем метод аффинной очистки фибринолитического фермента из Sipunculus nudus , который является простым, недорогим и эффективным.

Abstract

Фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE) является новым фибринолитическим агентом, который может как активировать плазминоген в плазмин, так и напрямую расщеплять фибрин, демонстрируя большие преимущества по сравнению с традиционными тромболитическими агентами. Однако из-за недостатка структурной информации все программы очистки sFE основаны на многоступенчатых хроматографических очистках, которые являются слишком сложными и дорогостоящими. Здесь впервые разработан протокол аффинной очистки sFE на основе кристаллической структуры sFE; он включает в себя подготовку сырого образца и колонки аффинной хроматографии лизина/аргинин-агарозной матрицы, аффинную очистку и характеристику очищенного sFE. Следуя этому протоколу, партия sFE может быть очищена в течение 1 дня. Кроме того, чистота и активность очищенного sFE увеличивается до 92% и 19 200 Ед/мл соответственно. Таким образом, это простой, недорогой и эффективный подход к очистке sFE. Разработка этого протокола имеет большое значение для дальнейшего использования sFE и других подобных агентов.

Introduction

Тромбоз представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения, особенно после глобальной пандемии Covid-19 ^1,2. Клинически многие активаторы плазминогена (ПА), такие как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и урокиназа (Великобритания), широко используются в качестве тромболитических препаратов. ПА могут активировать плазминоген пациентов в активный плазмин для расщепления фибрина. Таким образом, их тромболитическая эффективность сильно ограничена плазминогенным статусом пациентов ^3,4. Фибринолитические агенты, такие как металлопротеиназная....

Protocol

1. Подготовка

1. Обработка образцов
   1. Тщательно препарируют свежий S. nudus (100 г) и собирают кишечник и его внутреннюю жидкость.
   2. Добавьте 300 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, pH 7,4) для гомогенизации (1000 об/мин, 60 с).
   3. Заморозьте-разморозьте гомогенат 3 раза.
   4. Центрифугируют .......

Discussion

Из-за отсутствия точной последовательности генов sFE используемый в настоящее время sFE был извлечен из свежего S. nudus¹⁴. Кроме того, процедуры очистки sFE, описанные в литературе, были сложными и дорогостоящими, поскольку они основывались на некоторых общих характеристиках.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent