חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מקיפה להערכת הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון של סלידרוזיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7.

Abstract

Salidroside (Sal) מכיל פעילויות פרמקולוגיות אנטי מסרטנות, אנטי היפוקסיסיות ואנטי דלקתיות. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים שלה נגד סרטן השד הובהרו רק באופן חלקי. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לפענח את הפוטנציאל של Sal בוויסות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 בהתפשטות הממאירה של תאי MCF-7 של סרטן השד האנושי. ראשית, הפעילות הפרמקולוגית של Sal כנגד MCF-7 הוערכה על ידי CCK-8 ומבחני שריטות תאים. יתר על כן, העמידות של תאי MCF-7 נמדדה על ידי מבחני הגירה ופלישה מטריגל. עבור אפופטוזיס של תאים ומבחני מחזור, תאי MCF-7 עובדו בשלבים עם ANNEXIN V-FITC/PI וערכות זיהוי צביעת מחזור התא לניתוח ציטומטריית זרימה, בהתאמה. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) ו-Ca²⁺ נבדקו על ידי DCFH-DA וצביעה אימונופלואורסצנטית Fluo-4 AM. הפעילות של Na+-K+-ATPase ו- Ca²⁺-ATPase נקבעה באמצעות ערכות מסחריות מתאימות. רמות החלבון וביטוי הגנים באפופטוזיס ובמסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 נקבעו עוד יותר באמצעות ניתוחי כתם מערבי ו- qRT-PCR, בהתאמה. מצאנו כי טיפול Sal הגביל באופן משמעותי את ההתפשטות, הנדידה והפלישה של תאי MCF-7 עם השפעות תלויות מינון. בינתיים, ממשל סאל גם אילץ באופן דרמטי תאי MCF-7 לעבור אפופטוזיס ומעצר מחזור תאים. בדיקות האימונופלואורסנציה הראו כי Sal עורר באופן נצפה ייצור ROS ו- Ca²⁺ בתאי MCF-7. נתונים נוספים אישרו כי סאל קידם את רמות הביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, ואת הגנים המתאימים להם. באופן עקבי, התערבות Sal הפחיתה באופן בולט את הביטוי של חלבוני Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α ו-FoxO1 ואת הגנים המתאימים להם. לסיכום, Sal יכול לשמש כתרכובת פוטנציאלית שמקורה בצמחי מרפא לטיפול בסרטן השד, שכן הוא עשוי להפחית את ההתפשטות, הנדידה והפלישה הממאירה של תאי MCF-7 על ידי עיכוב מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

כאחד מסוגי הסרטן המאובחנים הנפוצים ביותר והממאירויות הנפוצות ביותר, הנתונים הסטטיסטיים האחרונים מצביעים על כך ש -2.3 מיליון מקרים של סרטן השד הופיעו ברחבי העולם עד שנת 2020, המהווים 11.7% מכלל מקרי הסרטן¹. תסמינים נפוצים של סרטן השד כוללים רגישות ועקצוץ בשדיים, גושים וכאבים בשדיים, הפרשות פטמות, שחיקה או עור שקוע, ובלוטות לימפה מוגדלות^בבית השחי ^1,2. מדאיג עוד יותר, מספר המקרים החדשים וההיארעות הכוללת של סרטן השד ממשיכים לעלות בקצב מכריע מדי שנה, ומהווים 6.9% ממקרי המוות הקשורים לסרטן¹. כיום, התערבות בסרטן השד עדיין כוללת בעיקר כימותרפיה, ניתוח, הקרנות וטיפול מקיף....

Protocol

תאי MCF-7 ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. תרבית תאים

1. תרבית את תאי MCF-7 באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ב-37°C עם DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין (10,000 U/mL)/סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים).
   הערה: התאים המכסים 90% מתחתית ?.......

Discussion

סרטן השד משפיע על אנשים בכל הגילאים וגורם לעומס פיזי ונפשי בל יתואר ולחץ כלכלי גדול¹. סרטן השד, עם התחלואה והתמותה ההולכות וגדלות שלו מדי שנה, משך תשומת לב עולמית גם במונחים של חיפוש טיפולים מורכבים מבוססי צמחי מרפא יעילים מעבר לטיפולים קונבנציונליים ^4,5

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018