דגימת נוזל מוחי ודם מווריד זנב לטרלי בחולדות במהלך רישומי EEG

Summary

הפרוטוקול מראה איסוף חוזר של נוזל המוח השדרה ודם מחולדות אפילפטיות, המבוצע במקביל לניטור וידאו-אלקטרואנצפלוגרם רציף (EEG). אלה חיוניים לחקר קשרים אפשריים בין שינויים במולקולות שונות של נוזל הגוף לבין פעילות התקפים.

Abstract

מכיוון שהרכב נוזלי הגוף משקף דינמיקות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות, דגימות נוזל ביולוגיות מתקבלות בדרך כלל בהקשרים ניסיוניים רבים כדי למדוד מולקולות מעניינות, כגון הורמונים, גורמי גדילה, חלבונים או רנ"א קטנים שאינם מקודדים. דוגמה ספציפית היא דגימה של נוזלים ביולוגיים במחקר של סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. במחקרים אלה, רצוי להשוות את רמות המולקולות בנוזל השדרה (CSF) ובפלזמה, על ידי משיכת CSF ופלזמה במקביל והתחשבות במרחק הזמן של הדגימה מהתקפים ואליהם. הדגימה המשולבת של CSF ופלזמה, יחד עם ניטור וידאו-EEG בבעלי חיים אפילפטיים, היא גישה מבטיחה לאימות של סמנים ביולוגיים אבחוניים ופרוגנוסטיים משוערים. כאן מתואר הליך של נסיגה משולבת של CSF מ- cisterna magna ודגימת דם מווריד הזנב הצידי בחולדות אפילפטיות המנוטרות באופן רציף באמצעות וידאו EEG. הליך זה מציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. הוא מאפשר דגימה מהירה עם מינימום כאב או פולשניות, וקיצור זמן ההרדמה. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי להשיג דגימות CSF ופלזמה הן בחולדות קשוחות והן בחולדות שנרשמו באמצעות טלמטריה, וניתן להשתמש בו שוב ושוב במשך מספר ימי ניסוי. על ידי מזעור הלחץ כתוצאה מהדגימה על ידי קיצור הרדמה איזופלורנית, המדדים צפויים לשקף בצורה מדויקת יותר את הרמות האמיתיות של מולקולות נחקרות בנוזלים ביולוגיים. בהתאם לזמינות של בדיקה אנליטית מתאימה, טכניקה זו עשויה לשמש למדידת רמות של מולקולות מרובות ושונות תוך ביצוע רישום EEG בו זמנית.

Introduction

נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודגימת דם חשובים לזיהוי ואימות סמנים ביולוגיים של אפילפסיה, הן במחקר פרה-קליני והן במחקר קליני ^1,2. כיום, האבחנה של אפילפסיה ורוב המחקר על סמנים ביולוגיים של אפילפסיה מתמקדים ב- EEG והדמיה מוחית ^3,4,5. גישות אלה, עם זאת, מציבות מספר מגבלות. מלבד מדידות שגרתיות בקרקפת, במקרים רבים, EEG דורש טכניקות פולשניות כמו אלקטרודות עומק⁶. שיטות הדמיה מוחית הן בעלות רזולוציה טמפורלית ומרחבית ירודה והן יקרות יחסית וגוזלות זמן ^7,8

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פרארה ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (אישור: D.M. 603/2022-PR) בהתאם להנחיות המפורטות בדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות. פרוטוקול זה.......

Discussion

העבודה הנוכחית מדגימה טכניקה קלה לשליטה של CSF ואיסוף דם בחולדות, אשר עשויה להיות שימושית לא רק למחקרים במודלים של אפילפסיה אלא גם של מצבים נוירולוגיים אחרים או מחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון או טרשת נפוצה. במחקר אפילפסיה, שני הליכי הדגימה יחד עם וידאו-EEG הם אידיאליים כאשר מחפשים מתאם בין רמו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material