Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG

Summary

O protocolo mostra repetidas coletas de líquido cefalorraquidiano e sangue de ratos epilépticos realizadas em paralelo com a monitorização contínua por vídeo-eletroencefalograma (EEG). Estes são instrumentais para explorar possíveis ligações entre alterações em várias moléculas de fluido corporal e atividade convulsiva.

Abstract

Como a composição dos fluidos corporais reflete muitas dinâmicas fisiológicas e patológicas, amostras líquidas biológicas são comumente obtidas em muitos contextos experimentais para medir moléculas de interesse, como hormônios, fatores de crescimento, proteínas ou pequenos RNAs não codificantes. Um exemplo específico é a amostragem de líquidos biológicos na pesquisa de biomarcadores para epilepsia. Nesses estudos, é desejável comparar os níveis de moléculas no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no plasma, retirando o LCR e o plasma em paralelo e considerando a distância temporal da amostragem de e para as convulsões. A coleta combinada de LCR e plasma, juntamente com o monitoramento por vídeo-EEG em animais epilépticos, é uma abordagem promissora para a validação de biomarcadores diagnósticos e prognósticos putativos. Neste artigo, descreve-se um procedimento de retirada combinada de LCR da cisterna magna e coleta de sangue da veia lateral da cauda em ratos epilépticos monitorados continuamente por vídeo-EEG. Este procedimento oferece vantagens significativas em relação a outras técnicas comumente utilizadas. Permite amostragem rápida com o mínimo de dor ou invasividade e tempo reduzido de anestesia. Além disso, ele pode ser usado para obter amostras de LCR e plasma em ratos registrados no EEG cativo e por telemetria, e pode ser usado repetidamente ao longo de vários dias de experimento. Ao minimizar o estresse devido à amostragem por meio do encurtamento da anestesia com isoflurano, espera-se que as medidas reflitam com mais precisão os verdadeiros níveis das moléculas investigadas em biofluidos. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico apropriado, essa técnica pode ser usada para medir os níveis de múltiplas moléculas diferentes ao mesmo tempo em que se realiza o registro do EEG.

Introduction

O líquido cefalorraquidiano (LCR) e a coleta de sangue são importantes para identificar e validar biomarcadores de epilepsia, tanto em pesquisas pré-clínicas quanto clínicas ^1,2. Atualmente, o diagnóstico de epilepsia e a maioria das pesquisas sobre biomarcadores de epilepsia concentram-se no EEG e na neuroimagem ^3,4,5. Essas abordagens, no entanto, apresentam várias limitações. Além das medidas rotineiras do couro cabeludo, o EEG requer, em muitos casos, técnicas invasivas como eletrodos de profundidade

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ferrara e pelo Ministério da Saúde italiano (autorização: D.M. 603/2022-PR) de acordo com as diretrizes delineadas na Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos. Este protocolo é especificamente ajustado para análises adicionais da reação em cadeia d.......

Discussion

O presente trabalho ilustra uma técnica fácil de dominar de coleta de líquor e sangue em ratos, que pode ser útil não apenas para estudos em modelos de epilepsia, mas também de outras condições neurológicas ou doenças como Alzheimer, Parkinson ou esclerose múltipla. Na pesquisa em epilepsia, ambos os procedimentos de amostragem acoplados ao vídeo-EEG são ideais quando se busca uma correlação entre os níveis de diferentes moléculas solúveis e a atividade convulsiva. Por esse motivo específico, foi empre.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material