A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.
העדשה היא איבר שקוף ואליפסואידי בחדר הקדמי של העין שמשנה צורה כדי למקד אור עדין על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. חלק הארי של רקמה זו מורכב מתאי סיבים מיוחדים, ממוינים, בעלי חתך משושה ונמשכים מהקוטב הקדמי ועד האחורי של העדשה. תאים ארוכים ורזים אלה מנוגדים מאוד לתאים שכנים ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות לאורך התא. המבנים השלובים המיוחדים נדרשים לתכונות ביומכניות רגילות של העדשה ותוארו בהרחבה באמצעות טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים. פרוטוקול זה מדגים את השיטה הראשונה לשימור ואימונוסטיין יחיד כמו גם צרורות של תאי סיבי עדשה עכבריים כדי לאפשר לוקליזציה מפורטת של חלבונים בתוך תאים בעלי צורה מורכבת זו. הנתונים המייצגים מראים צביעה של תאי הסיבים ההיקפיים, המתמיינים, הבוגרים והגרעיניים בכל אזורי העדשה. שיטה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי על תאי סיבים שבודדו מעדשות של מינים אחרים.
העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
עכברים טופלו על בסיס פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אינדיאנה בבלומינגטון. העכברים ששימשו ליצירת נתונים מייצגים היו חיות ביקורת (מסוג בר) ברקע C57BL6/J, נקבות ובנות 8-12 שבועות. ניתן להשתמש הן בעכברים זכרים והן בנקבות לניסוי זה, מאחר שהסבירות .......
תאי סיבי העדשה מוכנים מקליפת המוח של העדשה (סיבים מתמיינים וסיבים בוגרים) ומהגרעין, והתאים מוכתמים בפלואידין עבור F-אקטין ו-WGA עבור קרום התא. תערובת של צרורות תאים או סיבי עדשה בודדים (איור 3) נצפית ומצולמת. מקליפת המוח של העדשה נמצאים שני סוגי תאים (איור 3A). תא?.......
פרוטוקול זה הדגים את שיטות הקיבוע, השימור והצביעה החיסונית המשמרת נאמנה את המורפולוגיה של הממברנה התלת-ממדית של צרורות או תאי סיבי עדשה בודדים מעומקים שונים בעדשה. סיבי העדשה המוכתמים מושווים לתכשירי SEM המשמשים זה מכבר לחקר המורפולוגיה של תאי סיבי העדשה. התוצאות מראות מבני קרום דומים בין .......
עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 EY032056 (ל- CC) מהמכון הלאומי לעיניים. המחברים מודים לד"ר תרזה פאסל וקימברלי ונדרפול במתקן סקריפס למיקרוסקופיה על עזרתם בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
Nail polish | |||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
Primary antibody | |||
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
Secondary antibody | |||
Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved