Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.

Abstract

העדשה היא איבר שקוף ואליפסואידי בחדר הקדמי של העין שמשנה צורה כדי למקד אור עדין על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. חלק הארי של רקמה זו מורכב מתאי סיבים מיוחדים, ממוינים, בעלי חתך משושה ונמשכים מהקוטב הקדמי ועד האחורי של העדשה. תאים ארוכים ורזים אלה מנוגדים מאוד לתאים שכנים ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות לאורך התא. המבנים השלובים המיוחדים נדרשים לתכונות ביומכניות רגילות של העדשה ותוארו בהרחבה באמצעות טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים. פרוטוקול זה מדגים את השיטה הראשונה לשימור ואימונוסטיין יחיד כמו גם צרורות של תאי סיבי עדשה עכבריים כדי לאפשר לוקליזציה מפורטת של חלבונים בתוך תאים בעלי צורה מורכבת זו. הנתונים המייצגים מראים צביעה של תאי הסיבים ההיקפיים, המתמיינים, הבוגרים והגרעיניים בכל אזורי העדשה. שיטה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי על תאי סיבים שבודדו מעדשות של מינים אחרים.

Introduction

העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protocol

עכברים טופלו על בסיס פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אינדיאנה בבלומינגטון. העכברים ששימשו ליצירת נתונים מייצגים היו חיות ביקורת (מסוג בר) ברקע C57BL6/J, נקבות ובנות 8-12 שבועות. ניתן להשתמש הן בעכברים זכרים והן בנקבות לניסוי זה, מאחר שהסבירות .......

Representative Results

תאי סיבי העדשה מוכנים מקליפת המוח של העדשה (סיבים מתמיינים וסיבים בוגרים) ומהגרעין, והתאים מוכתמים בפלואידין עבור F-אקטין ו-WGA עבור קרום התא. תערובת של צרורות תאים או סיבי עדשה בודדים (איור 3) נצפית ומצולמת. מקליפת המוח של העדשה נמצאים שני סוגי תאים (איור 3A). תא?.......

Discussion

פרוטוקול זה הדגים את שיטות הקיבוע, השימור והצביעה החיסונית המשמרת נאמנה את המורפולוגיה של הממברנה התלת-ממדית של צרורות או תאי סיבי עדשה בודדים מעומקים שונים בעדשה. סיבי העדשה המוכתמים מושווים לתכשירי SEM המשמשים זה מכבר לחקר המורפולוגיה של תאי סיבי העדשה. התוצאות מראות מבני קרום דומים בין .......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 EY032056 (ל- CC) מהמכון הלאומי לעיניים. המחברים מודים לד"ר תרזה פאסל וקימברלי ונדרפול במתקן סקריפס למיקרוסקופיה על עזרתם בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60mm plateFisherScientificFB0875713A
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
10X phosphate buffered salineThermoFisher70011-044
1X phosphate buffered salineThermoFisher14190136
48-well plateCytoOneCC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)FisherScientific12-553-467
Curved tweezersWorld Precision Instruments501981
Dissection microscopeCarl ZeissStereo Discovery V8
Fine tip straight tweezersElectron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherScientific12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 SoftwareCarl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin (rhodamine)ThermoFisherR415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11VWR76241-186
Secondary antibody
Straight forcepsWorld Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)FisherScientific12-565-154
Ultra-fine scissorsWorld Precision Instruments501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)Vector LaboratoriesFL-1021-5

References

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved