הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.

Abstract

העדשה היא איבר שקוף ואליפסואידי בחדר הקדמי של העין שמשנה צורה כדי למקד אור עדין על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. חלק הארי של רקמה זו מורכב מתאי סיבים מיוחדים, ממוינים, בעלי חתך משושה ונמשכים מהקוטב הקדמי ועד האחורי של העדשה. תאים ארוכים ורזים אלה מנוגדים מאוד לתאים שכנים ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות לאורך התא. המבנים השלובים המיוחדים נדרשים לתכונות ביומכניות רגילות של העדשה ותוארו בהרחבה באמצעות טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים. פרוטוקול זה מדגים את השיטה הראשונה לשימור ואימונוסטיין יחיד כמו גם צרורות של תאי סיבי עדשה עכבריים כדי לאפשר לוקליזציה מפורטת של חלבונים בתוך תאים בעלי צורה מורכבת זו. הנתונים המייצגים מראים צביעה של תאי הסיבים ההיקפיים, המתמיינים, הבוגרים והגרעיניים בכל אזורי העדשה. שיטה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי על תאי סיבים שבודדו מעדשות של מינים אחרים.

Introduction

העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protocol

עכברים טופלו על בסיס פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אינדיאנה בבלומינגטון. העכברים ששימשו ליצירת נתונים מייצגים היו חיות ביקורת (מסוג בר) ברקע C57BL6/J, נקבות ובנות 8-12 שבועות. ניתן להשתמש הן בעכברים זכרים והן בנקבות לניסוי זה, מאחר שהסבירות .......

Discussion

פרוטוקול זה הדגים את שיטות הקיבוע, השימור והצביעה החיסונית המשמרת נאמנה את המורפולוגיה של הממברנה התלת-ממדית של צרורות או תאי סיבי עדשה בודדים מעומקים שונים בעדשה. סיבי העדשה המוכתמים מושווים לתכשירי SEM המשמשים זה מכבר לחקר המורפולוגיה של תאי סיבי העדשה. התוצאות מראות מבני קרום דומים בין .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5