A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.
בעת ניטור מחלה שיורית מינימלית (MRD) לאחר טיפול בגידול, ישנן דרישות גבוהות יותר של הגבול התחתון של גילוי מאשר בעת גילוי מוטציות עמידות לתרופות ומוטציות תאי גידול במחזור במהלך הטיפול. ריצוף סנגר מסורתי כולל 5%-20% זיהוי מוטציות מסוג פרא, כך שמגבלת הגילוי שלו אינה יכולה לעמוד בדרישות המתאימות. טכנולוגיות החסימה מסוג פרא שדווח כי התגברו על כך כוללות הגברת תזוזה חוסמת (BDA), חומצת גרעין נעולה שאינה ניתנת להארכה (LNA), בדיקות ספציפיות לנקודה חמה (HSSP) וכו '. טכנולוגיות אלה משתמשות ברצפי אוליגונוקלאוטידים ספציפיים כדי לחסום סוג פראי או לזהות סוג פראי ולאחר מכן משלבות זאת עם שיטות אחרות כדי למנוע הגברה מסוג פראי ולהגביר הגברה מוטנטית, מה שמוביל למאפיינים כמו רגישות גבוהה, גמישות ונוחות. פרוטוקול זה משתמש ב- BDA, PCR חוסם מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%, מה שיכול לספק בסיס לניטור MRD של לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T.
מחלה שיורית מינימלית (MRD) היא המספר הקטן של תאים סרטניים שעדיין נמצאים בגוף לאחר הטיפול. בשל מספרם הקטן, הם אינם מובילים לסימנים או תסמינים פיזיים כלשהם. לעתים קרובות הם אינם מזוהים בשיטות מסורתיות, כגון הדמיה מיקרוסקופית ו / או מעקב אחר חלבונים חריגים בסרום בדם. תוצאת בדיקת MRD חיובית מצביעה על נוכחות של תאים חולים שיורית. תוצאה שלילית פירושה כי תאים חולים שיורית נעדרים. לאחר טיפול סרטני, התאים הסרטניים הנותרים בגוף יכולים להיות פעילים ולהתחיל להתרבות, גרימת הישנות המחלה. גילוי MRD מעיד על כך שהטיפול לא היה יעיל לחלוטין או שהטיפול לא היה שלם. סיבה נוספת לתוצאות MRD חיוביות לאחר הטיפול עשויה להיות שלא כל התאים ה....
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המרכזי יונגג'ואו (מספר אישור: 2024022601). המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.
1. עיצוב פריימר
השווה את רצף דגימת הבדיקה לרצף הייחוס כדי לקבל את מצב המוטציה של דגימת הבדיקה. טכנולוגיית WBT-PCR מבוססת BDA יכולה לזהות את מוטציית RHOA G17V הידועה ומוטציות אחרות בתדר נמוך במרווח ההגברה של פריימרים במעלה ובמורד הזרם. ראו איור 1. שני גנים נוספים, כלומר IDH2 ו-.......
WTB-PCR המבוסס על טכנולוגיית BDA, המתואר במאמר זה, מציג פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי, לדכא את הסוג הפראי ולהגביר את המוצר המוטנטי. לאחר מכן, מוצרי WTB-PCR רוצפו לניתוח מוטציות. השירות של WTB-PCR / Sanger הוא הפשטות והרגישו?.......
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה הושלם בתמיכה כספית של Kindstar Global Corporation ובעזרתם של מנהיגי המעבדה לביולוגיה מולקולרית ועמיתים קשורים. תודה לחברה, למנהיגים ולעמיתים הרלוונטיים על התמיכה והעזרה. מאמר זה משמש למחקר מדעי בלבד ואינו מהווה פעילות מסחרית כלשהי.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Automatic DNA extractor | 9001301 | Qiagen | |
DNA nucleic acid detector | Q32854 | Thermo fisher | |
PCR amplification kit | P4600 | merck | |
PCR instrument | C1000 Touch | Biorad | |
proteinase K solution | D3001-2-A | zymo research | |
proteinase K storage buffer | D3001-2-C | zymo research | |
Sequencing amplification enzyme kit | P7670-FIN | Qiagen |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved