Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

Abstract

בעת ניטור מחלה שיורית מינימלית (MRD) לאחר טיפול בגידול, ישנן דרישות גבוהות יותר של הגבול התחתון של גילוי מאשר בעת גילוי מוטציות עמידות לתרופות ומוטציות תאי גידול במחזור במהלך הטיפול. ריצוף סנגר מסורתי כולל 5%-20% זיהוי מוטציות מסוג פרא, כך שמגבלת הגילוי שלו אינה יכולה לעמוד בדרישות המתאימות. טכנולוגיות החסימה מסוג פרא שדווח כי התגברו על כך כוללות הגברת תזוזה חוסמת (BDA), חומצת גרעין נעולה שאינה ניתנת להארכה (LNA), בדיקות ספציפיות לנקודה חמה (HSSP) וכו '. טכנולוגיות אלה משתמשות ברצפי אוליגונוקלאוטידים ספציפיים כדי לחסום סוג פראי או לזהות סוג פראי ולאחר מכן משלבות זאת עם שיטות אחרות כדי למנוע הגברה מסוג פראי ולהגביר הגברה מוטנטית, מה שמוביל למאפיינים כמו רגישות גבוהה, גמישות ונוחות. פרוטוקול זה משתמש ב- BDA, PCR חוסם מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%, מה שיכול לספק בסיס לניטור MRD של לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T.

Introduction

מחלה שיורית מינימלית (MRD) היא המספר הקטן של תאים סרטניים שעדיין נמצאים בגוף לאחר הטיפול. בשל מספרם הקטן, הם אינם מובילים לסימנים או תסמינים פיזיים כלשהם. לעתים קרובות הם אינם מזוהים בשיטות מסורתיות, כגון הדמיה מיקרוסקופית ו / או מעקב אחר חלבונים חריגים בסרום בדם. תוצאת בדיקת MRD חיובית מצביעה על נוכחות של תאים חולים שיורית. תוצאה שלילית פירושה כי תאים חולים שיורית נעדרים. לאחר טיפול סרטני, התאים הסרטניים הנותרים בגוף יכולים להיות פעילים ולהתחיל להתרבות, גרימת הישנות המחלה. גילוי MRD מעיד על כך שהטיפול לא היה יעיל לחלוטין או שהטיפול לא היה שלם. סיבה נוספת לתוצאות MRD חיוביות לאחר הטיפול עשויה להיות שלא כל התאים ה....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המרכזי יונגג'ואו (מספר אישור: 2024022601). המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.

1. עיצוב פריימר

  1. עיצוב פריימר קונבנציונלי: עיצוב פריימרים על פי כללי עיצוב פריימר20 המדווחים, עיצוב פריימר על ידי N.......

Representative Results

השווה את רצף דגימת הבדיקה לרצף הייחוס כדי לקבל את מצב המוטציה של דגימת הבדיקה. טכנולוגיית WBT-PCR מבוססת BDA יכולה לזהות את מוטציית RHOA G17V הידועה ומוטציות אחרות בתדר נמוך במרווח ההגברה של פריימרים במעלה ובמורד הזרם. ראו איור 1. שני גנים נוספים, כלומר IDH2 ו-.......

Discussion

WTB-PCR המבוסס על טכנולוגיית BDA, המתואר במאמר זה, מציג פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי, לדכא את הסוג הפראי ולהגביר את המוצר המוטנטי. לאחר מכן, מוצרי WTB-PCR רוצפו לניתוח מוטציות. השירות של WTB-PCR / Sanger הוא הפשטות והרגישו?.......

Acknowledgements

מחקר זה הושלם בתמיכה כספית של Kindstar Global Corporation ובעזרתם של מנהיגי המעבדה לביולוגיה מולקולרית ועמיתים קשורים. תודה לחברה, למנהיגים ולעמיתים הרלוונטיים על התמיכה והעזרה. מאמר זה משמש למחקר מדעי בלבד ואינו מהווה פעילות מסחרית כלשהי.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Automatic DNA extractor9001301Qiagen
DNA nucleic acid detectorQ32854Thermo fisher
PCR amplification kitP4600merck
PCR instrumentC1000 TouchBiorad
proteinase K solutionD3001-2-Azymo research
proteinase K storage bufferD3001-2-Czymo research
Sequencing amplification enzyme kitP7670-FINQiagen

References

Explore More Articles

210WTB PCRAITLRHOA G17V

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved