חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

Summary

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

Abstract

בעת ניטור מחלה שיורית מינימלית (MRD) לאחר טיפול בגידול, ישנן דרישות גבוהות יותר של הגבול התחתון של גילוי מאשר בעת גילוי מוטציות עמידות לתרופות ומוטציות תאי גידול במחזור במהלך הטיפול. ריצוף סנגר מסורתי כולל 5%-20% זיהוי מוטציות מסוג פרא, כך שמגבלת הגילוי שלו אינה יכולה לעמוד בדרישות המתאימות. טכנולוגיות החסימה מסוג פרא שדווח כי התגברו על כך כוללות הגברת תזוזה חוסמת (BDA), חומצת גרעין נעולה שאינה ניתנת להארכה (LNA), בדיקות ספציפיות לנקודה חמה (HSSP) וכו '. טכנולוגיות אלה משתמשות ברצפי אוליגונוקלאוטידים ספציפיים כדי לחסום סוג פראי או לזהות סוג פראי ולאחר מכן משלבות זאת עם שיטות אחרות כדי למנוע הגברה מסוג פראי ולהגביר הגברה מוטנטית, מה שמוביל למאפיינים כמו רגישות גבוהה, גמישות ונוחות. פרוטוקול זה משתמש ב- BDA, PCR חוסם מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%, מה שיכול לספק בסיס לניטור MRD של לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T.

Introduction

מחלה שיורית מינימלית (MRD) היא המספר הקטן של תאים סרטניים שעדיין נמצאים בגוף לאחר הטיפול. בשל מספרם הקטן, הם אינם מובילים לסימנים או תסמינים פיזיים כלשהם. לעתים קרובות הם אינם מזוהים בשיטות מסורתיות, כגון הדמיה מיקרוסקופית ו / או מעקב אחר חלבונים חריגים בסרום בדם. תוצאת בדיקת MRD חיובית מצביעה על נוכחות של תאים חולים שיורית. תוצאה שלילית פירושה כי תאים חולים שיורית נעדרים. לאחר טיפול סרטני, התאים הסרטניים הנותרים בגוף יכולים להיות פעילים ולהתחיל להתרבות, גרימת הישנות המחלה. גילוי MRD מעיד על כך שהטיפול לא היה יעיל לחלוטין או שהטיפול לא היה שלם. סיבה נוספת לתוצאות MRD חיוביות לאחר הטיפול עשויה להיות שלא כל התאים ה....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המרכזי יונגג'ואו (מספר אישור: 2024022601). המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.

1. עיצוב פריימר

1. עיצוב פריימר קונבנציונלי: עיצוב פריימרים על פי כללי עיצוב פריימר²⁰ המדווחים, עיצוב פריימר על ידי N.......

Discussion

WTB-PCR המבוסס על טכנולוגיית BDA, המתואר במאמר זה, מציג פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי, לדכא את הסוג הפראי ולהגביר את המוצר המוטנטי. לאחר מכן, מוצרי WTB-PCR רוצפו לניתוח מוטציות. השירות של WTB-PCR / Sanger הוא הפשטות והרגישו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen