PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

Summary

Este artigo apresenta a aplicação de um método de detecção de baixa frequência baseado no sequenciamento de Sanger no linfoma angioimunoblástico. Forneça uma base para aplicar este método a outras doenças.

Abstract

Ao monitorar a doença residual mínima (MRD) após o tratamento do tumor, há requisitos mais altos do limite inferior de detecção do que ao detectar mutações de resistência a medicamentos e mutações de células tumorais circulantes durante a terapia. O sequenciamento Sanger tradicional tem detecção de mutação do tipo selvagem de 5% a 20%, portanto, seu limite de detecção não pode atender aos requisitos correspondentes. As tecnologias de bloqueio do tipo selvagem que foram relatadas para superar isso incluem amplificação de deslocamento do bloqueador (BDA), ácido nucleico bloqueado não extensível (LNA), sondas específicas de pontos quentes (HSSP), etc. Essas tecnologias usam sequências específicas de oligonucleotídeos para bloquear o tipo selvagem ou reconhecer o tipo selvagem e, em seguida, combinam isso com outros métodos para evitar a amplificação do tipo selvagem e amplificar a amplificação mutante, levando a características como alta sensibilidade, flexibilidade e conveniência. Este protocolo usa BDA, uma PCR de bloqueio de tipo selvagem combinada com sequenciamento de Sanger, para otimizar a detecção de mutações somáticas de baixa frequência RHOA G17V, e a sensibilidade de detecção pode chegar a 0,5%, o que pode fornecer uma base para o monitoramento de MRD de linfoma angioimunoblástico de células T.

Introduction

A doença residual mínima (MRD) é o pequeno número de células cancerígenas que ainda estão presentes no corpo após o tratamento. Devido ao seu pequeno número, eles não levam a nenhum sinal ou sintoma físico. Eles geralmente não são detectados por métodos tradicionais, como visualização microscópica e / ou rastreamento de proteínas séricas anormais no sangue. Um resultado de teste positivo para DRM indica a presença de células doentes residuais. Um resultado negativo significa que as células doentes residuais estão ausentes. Após o tratamento do câncer, as células cancerígenas restantes no corpo podem se tornar ati....

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo comitê de revisão de ética médica do Hospital Central de Yongzhou (número de aprovação: 2024022601). Os participantes forneceram consentimento informado.

1. Projeto da primeira demão

1. Projeto de primer convencional: Projete primers de acordo com as regras de design de primer relatadas²⁰, design de primer por NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast.......

Discussion

O WTB-PCR baseado na tecnologia BDA, descrito neste artigo, introduz um primer incompatível complementar ao tipo mutante ao projetar primers convencionais para competir com o tipo selvagem, suprimir o tipo selvagem e amplificar o produto mutante. Em seguida, os produtos WTB-PCR foram sequenciados para análise de mutação. A utilidade do WTB-PCR / Sanger é sua simplicidade e alta sensibilidade. De acordo com o esquema de detecção estabelecido neste artigo, a maioria dos ensaios base.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen