ПЦР с блокированием дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру для выявления низкочастотных соматических мутаций

Summary

В данной статье представлено применение метода низкочастотного детектирования, основанного на секвенировании по Сэнгеру при ангиоиммунобластной лимфоме. Дают основание для применения данного метода при других заболеваниях.

Abstract

При мониторинге минимальной остаточной болезни (МОБ) после лечения опухолей существуют более высокие требования к нижнему пределу обнаружения, чем при выявлении мутаций лекарственной устойчивости и мутаций циркулирующих опухолевых клеток во время терапии. Традиционное секвенирование по Сэнгеру имеет 5%-20% обнаружения мутаций дикого типа, поэтому его предел обнаружения не может соответствовать соответствующим требованиям. Технологии блокирования дикого типа, которые, как сообщается, преодолевают эту проблему, включают амплификацию смещения блокаторов (BDA), нерасширяемые заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA), зонды, специфичные для горячих точек (HSSP) и т. д. Эти технологии используют определенные олигонуклеотидные последовательности для блокирования дикого типа или распознавания дикого типа, а затем комбинируют это с другими методами для предотвращения амплификации дикого типа и амплификации мутантных мутантов, что приводит к таким характеристикам, как высокая чувствительность, гибкость и удобство. В этом протоколе используется BDA, блокирующая ПЦР дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру, для оптимизации обнаружения низкочастотных соматических мутаций RHOA G17V, а чувствительность обнаружения может достигать 0,5%, что может обеспечить основу для мониторинга МОБ ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы.

Introduction

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) — это небольшое количество раковых клеток, которые все еще присутствуют в организме после лечения. Благодаря своему небольшому количеству, они не приводят к каким-либо физическим признакам или симптомам. Они часто остаются незамеченными с помощью традиционных методов, таких как микроскопическая визуализация и/или отслеживание аномальных сывороточных белков в крови. Положительный результат теста на МОБ указывает на наличие остаточных пораженных клеток. Отрицательный результат означает, что остаточные больные клетки отсутствуют. После лечения рака оставшиеся в организме раковые ....

Protocol

Данное исследование было одобрено комитетом по рассмотрению медицинской этики Центральной больницы Юнчжоу (номер одобрения: 2024022601). Участники дали информированное согласие.

1. Дизайн грунтовки

1. Традиционная конструкция грунтовки: Разраб.......

Discussion

WTB-ПЦР на основе технологии BDA, описанной в этой статье, вводит несовпадающий праймер, комплементарный мутантному типу при разработке обычных праймеров, чтобы конкурировать с диким типом, подавлять дикий тип и амплифицировать мутантный продукт. Затем продукты WTB-PCR был.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen