הכנת זרעי דקל קשים לניתוח ספקטרומטריית מסה בסיוע מטריקס בלייזר/יינון-הדמיה

Summary

פרוטוקול זה נועד לתאר הנחיות מפורטות להכנת קטעי דגימת זרעים קשים עם תכולת מים נמוכה לניתוח MALDI-IMS, שמירה על הפיזור והשפע המקוריים של האנליסטים ומתן אות ורזולוציה מרחבית באיכות גבוהה.

Abstract

ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) מיושמת לזיהוי תרכובות בסביבות הטבעיות שלהן. נכון לעכשיו, MALDI-IMS משמש לעתים קרובות בניתוח קליני. ובכל זאת, קיימת פרספקטיבה מצוינת ליישום טוב יותר של טכניקה זו להבנת המידע הפיזיולוגי של תרכובות כימיות ברקמות צמחים. עם זאת, ההכנה עשויה להיות מאתגרת עבור דגימות ספציפיות מחומרים בוטניים, מכיוון ש- MALDI-IMS דורש פרוסות דקות (12-20 מיקרומטר) לרכישת נתונים מתאימה וניתוח מוצלח. במובן זה, בעבר, פיתחנו פרוטוקול הכנת דגימות כדי להשיג מקטעים דקים של זרעים קשים של Euterpe oleracea (דקל açaí), המאפשר את המיפוי המולקולרי שלהם על ידי MALDI-IMS.

כאן, אנו מראים כי הפרוטוקול שפותח מתאים להכנת זרעים אחרים מאותו סוג. בקצרה, הפרוטוקול התבסס על טבילת הזרעים במים נטולי יונים, הטבעה של דגימות עם ג'לטין, וחתך אותם בהקפאה מאוקלמת. לאחר מכן, עבור שקיעת מטריצה, פלטפורמת תנועה xy הוצמדה לתרסיס מחט יינון אלקטרוספריי (ESI) באמצעות 1:1 (v/v) 2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) ותמיסת מתנול עם 0.1% חומצה trifluoroacetic ב 30 מ"ג / מ"ל. נתוני זרעי E. precatoria ו- E. edulis עובדו באמצעות תוכנה כדי למפות את דפוסי המטבוליטים שלהם.

אוליגומרים הקסוזים מופו בתוך פרוסות דגימה כדי להוכיח את נאותות הפרוטוקול עבור דגימות אלה, שכן ידוע כי זרעים אלה מכילים כמויות גדולות של מנאן, פולימר של מנוז הקסוס. כתוצאה מכך, זוהו פסגות של אוליגומרים הקסוזיים, המיוצגים על ידי [M + K]⁺ adducts of (Δ = 162 Da). לפיכך, פרוטוקול הכנת הדגימה, שפותח בעבר בהתאמה אישית עבור זרעי E. oleracea , איפשר גם ניתוח MALDI-IMS של שני זרעי דקל קשים אחרים. בקיצור, השיטה יכולה להוות כלי רב ערך למחקר במורפו-אנטומיה ובפיזיולוגיה של חומרים בוטניים, במיוחד מדגימות עמידות לחיתוך.

Introduction

ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת הקצאה דו-ממדית של ביומולקולות, מספקת חקירה לא ממוקדת של תרכובות מייננות וקובעת את התפלגותן המרחבית, במיוחד בדגימות ביולוגיות ^1,2. במשך שני עשורים, טכניקה זו אפשרה זיהוי בו זמנית של שומנים, פפטידים, פחמימות, חלבונים, מטבוליטים אחרים, ומולקולות סינתטיות כגון תרופות טיפוליות ^3,4. MALDI-IMS מאפשר ניתוח כימי במשטח דגימת רקמה ללא מיצוי, טיהור, הפרדה, תיוג או צביעה של דגימות ביולוגיות. עם זאת, לניתוח מוצלח, שלב מרכזי בטכניקה זו הוא הכנת הדגימה, במיוחד ברקמות צמחים,....

Protocol

זרעי Euterpe precatoria נתרמו באדיבות על ידי המכון הלאומי לפסקיסאס דה אמזוניה (מנאוס, ברזיל), וזרעי Euterpe edulis נתרמו באדיבות על ידי Silo - Arte e Latitude Rural (רסנדה, ברזיל) לאחר תהליך הפירוק התעשייתי. הזרעים נשמרו בקופסאות פלסטיק אטומות בטמפרטורת החדר.

1. ספקטרוסקופיית מסה בסיוע לייז.......

Discussion

צמחים מורכבים מרקמות מיוחדות עבור פונקציות ביוכימיות ספציפיות. לכן, פרוטוקול הכנת הדגימות עבור MALDI-IMS חייב להיות מתוכנן על פי רקמות צמחים שונות בעלות תכונות פיסיקוכימיות ספציפיות, שכן הדגימות חייבות לשמור על פיזור האנליזה והשפע המקוריים שלהן לקבלת אות באיכות גבוהה ורזולוציה מרחבית

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK