Preparazione di semi di palma dura per l'analisi di spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice

Summary

Questo protocollo mirava a descrivere una guida dettagliata sulla preparazione di sezioni di campioni di semi duri a basso contenuto d'acqua per l'analisi MALDI-IMS, mantenendo la distribuzione e l'abbondanza originali degli analiti e fornendo un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale.

Abstract

La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) viene applicata per identificare i composti nei loro ambienti nativi. Attualmente, MALDI-IMS è frequentemente utilizzato nelle analisi cliniche. Tuttavia, esiste un'ottima prospettiva per una migliore applicazione di questa tecnica per comprendere le informazioni fisiologiche dei composti chimici nei tessuti vegetali. Tuttavia, la preparazione può essere impegnativa per campioni specifici da materiali botanici, poiché MALDI-IMS richiede fette sottili (12-20 μm) per un'acquisizione dati appropriata e un'analisi di successo. In questo senso, in precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo di preparazione del campione per ottenere sezioni sottili di semi duri di Euterpe oleracea (palma açaí), consentendo la loro mappatura molecolare mediante MALDI-IMS.

Qui, mostriamo che il protocollo sviluppato è adatto per la preparazione di altri semi dello stesso genere. In breve, il protocollo si basava sull'immersione dei semi in acqua deionizzata per 24 ore, sull'inclusione di campioni con gelatina e sul sezionamento in un criostato acclimatato. Quindi, per la deposizione della matrice, una piattaforma di movimento xy è stata accoppiata a uno spruzzo ad ago a ionizzazione elettrospray (ESI) utilizzando una soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e metanolo 1:1 (v/v) con acido trifluoroacetico allo 0,1% a 30 mg/mL. I dati dei semi di E. precatoria ed E. edulis sono stati elaborati utilizzando un software per mappare i loro modelli di metaboliti.

Gli oligomeri di esoso sono stati mappati all'interno di fette di campione per dimostrare l'adeguatezza del protocollo per quei campioni, poiché è noto che quei semi contengono grandi quantità di mannano, un polimero dell'esoso mannosio. Di conseguenza, sono stati identificati picchi di oligomeri esosi, rappresentati da addotti [M + K]⁺ di (Δ = 162 Da). Pertanto, il protocollo di preparazione del campione, precedentemente sviluppato su misura per i semi di E. oleracea , ha consentito anche l'analisi MALDI-IMS di altri due semi di palma dura. In breve, il metodo potrebbe costituire un valido strumento per la ricerca nella morfo-anatomia e fisiologia dei materiali botanici, in particolare da campioni resistenti al taglio.

Introduction

La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) è un metodo potente che consente l'assegnazione bidimensionale di biomolecole, fornisce un'indagine non mirata di composti ionizzabili e determina la loro distribuzione spaziale, specialmente nei campioni biologici ^1,2. Per due decenni, questa tecnica ha permesso il rilevamento e l'identificazione simultanei di lipidi, peptidi, carboidrati, proteine, altri metaboliti e molecole sintetiche come i farmaci terapeutici ^3,4. MALDI-IMS facilita l'analisi chim....

Protocol

I semi di Euterpe precatoria sono stati gentilmente donati dall'Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasile), e i semi di Euterpe edulis sono stati gentilmente donati dal Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasile) dopo il processo di spolpamento industriale. I semi sono stati conservati in scatole di plastica sigillate a temperatura ambiente.

1. Spettroscopia di massa per desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS)

Discussion

Le piante sono composte da tessuti specializzati per specifiche funzioni biochimiche. Pertanto, il protocollo di preparazione del campione per MALDI-IMS deve essere progettato in base a vari tessuti vegetali con specifiche proprietà fisico-chimiche, poiché i campioni devono mantenere la distribuzione e l'abbondanza dell'analita originale per un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale⁸.

Prima dell'analisi MALDI-IMS, la considerazione principale è la raccol.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK