קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)

Summary

פרוטוקול זה חוקר את השימוש בפלזמה עשירה בשלפוחית חוץ-תאית (EV) כאינדיקטור ליכולת הקרישה של EV. פלזמה עשירה ב- EV מתקבלת באמצעות תהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית והסתיידות לאחר מכן.

Abstract

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) במחלות שונות זוכה לתשומת לב מוגברת, במיוחד בשל פעילותן החזקה כחומר קרישה. עם זאת, יש צורך דחוף בבדיקה ליד המיטה כדי להעריך את פעילות הקרישה של EV במסגרות קליניות. מחקר זה מציע להשתמש בזמן הפעלת תרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי כמדד לפעילות הקרישה של EV. נהלים סטנדרטיים ננקטו כדי להשיג דם שלם נתרן ציטרלי, ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לקבל פלזמה עשירה EV. הפלזמה העשירה ברכב חשמלי וסידן כלורי נוספו לכוס הבדיקה, והשינויים בצמיגות נוטרו בזמן אמת באמצעות אנלייזר. זמן הקרישה הטבעי של פלזמה עשירה ב-EV, המכונה EV-ACT, נקבע. התוצאות הראו עלייה משמעותית ב-EV-ACT כאשר EV הוסר מפלזמה שהתקבלה ממתנדבים בריאים, בעוד שהיא ירדה משמעותית כאשר EV הועשר. יתר על כן, EV-ACT קוצר במידה ניכרת בדגימות אנושיות מרעלת הריון, שבר בירך וסרטן ריאות, מה שמצביע על רמות גבוהות של EV פלזמה וקידום קרישת יתר בדם. עם ההליך הפשוט והמהיר שלו, EV-ACT מראה הבטחה כמבחן ליד המיטה להערכת תפקוד הקרישה בחולים עם רמות גבוהות של EV בפלזמה.

Introduction

פקקת, הנגרמת על ידי קרישיות יתר, ממלאת תפקיד משמעותי במחלות שונות, כולל טראומה מוחית¹, רעלת הריון², גידולים³ וחולי שבר⁴. המנגנון העומד בבסיס קרישיות יתר הוא מורכב, ולאחרונה הושם דגש על תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) בהפרעות קרישה. כלי רכב חשמליים הם גופים דמויי שלפוחית בעלי מבנה דו-שכבתי המתנתקים מקרום התא, בקוטר שבין 10 ננומטר ל-1000 ננומטר. הם קשורים למגוון תהליכי מחלה, במיוחד הפרעות קרישה⁵. מספר מחקרים זיהו רכבים חשמליים כמנבא מבטיח לסיכון לפקקת ^6,7. פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים תלו....

Protocol

איסוף דגימות האדם אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הכללי של האוניברסיטה הרפואית בטיאן-ג'ין. איסוף הדם הוורידי האנושי עקב בקפדנות אחר ההנחיה שפורסמה על ידי ועדת הבריאות הלאומית של סין, כלומר WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. בקצרה, נאסף דם מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מווריד הא?.......

Discussion

במחקר זה תוארה הכנת פלזמה עשירה ב-EV, ורציונליות השיטה אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, דגימות הפלזמה המסוידות נותחו במשך זמן ACT באמצעות מנתח קריש המבוסס על עקרונות צמיגות²⁴. כפי שניתן לראות באיור 3A, נמצא כי ריכוז כלי הרכב החשמליים המתקבלים באמצעות אולט?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.