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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo investiga o uso de plasma rico em vesículas extracelulares (VE) como indicador da capacidade coagulativa da VE. O plasma rico em EV é obtido através de um processo de centrifugação diferencial e subsequente recalcificação.

Abstract

O papel das vesículas extracelulares (VE) em várias doenças vem ganhando atenção crescente, particularmente devido à sua potente atividade pró-coagulante. No entanto, há uma necessidade urgente de um teste à beira do leito para avaliar a atividade pró-coagulante da EV em ambientes clínicos. Este estudo propõe o uso do tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV como medida da atividade pró-coagulante da EV. Procedimentos padronizados foram empregados para obtenção de sangue total citrato de sódio, seguido de centrifugação diferencial para obtenção de plasma rico em EV. O plasma rico em EV e o cloreto de cálcio foram adicionados à ventosa, e as mudanças na viscoelasticidade foram monitoradas em tempo real usando um analisador. O tempo natural de coagulação do plasma rico em EV, referido como EV-ACT, foi determinado. Os resultados revelaram um aumento significativo no EV-ACT quando EV foi removido do plasma obtido de voluntários saudáveis, enquanto diminuiu significativamente quando EV foi enriquecido. Além disso, EV-ACT foi consideravelmente encurtado em amostras humanas de pré-eclâmpsia, fratura de quadril e câncer de pulmão, indicando níveis elevados de EV plasmático e promoção de hipercoagulação sanguínea. Com seu procedimento simples e rápido, o EV-ACT mostra-se promissor como um teste à beira do leito para avaliar a função da coagulação em pacientes com altos níveis plasmáticos de EV.

Introduction

A trombose, causada pela hipercoagulabilidade, desempenha um papel significativo em várias doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico1, pré-eclâmpsia2, tumores3 e pacientes fraturados4. O mecanismo subjacente à hipercoagulabilidade é complexo, e ênfase recente tem sido dada ao papel das vesículas extracelulares (VE) nos distúrbios de coagulação. EVs são corpos vesiculares com uma estrutura bicamada que se desprendem da membrana celular, variando em diâmetro de 10 nm a 1000 nm. Estão associados a uma variedade de processos patológicos, particularmente distúrbios de coag....

Protocol

A coleta de amostras humanas foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Tianjin Medical University General Hospital. A coleta de sangue venoso humano seguiu rigorosamente a diretriz emitida pela Comissão Nacional de Saúde da China, ou seja, a Diretriz WS/T 661-2020 para Coleta de Amostras de Sangue Venoso. Resumidamente, o sangue foi coletado de indivíduos sadios com consentimento informado da veia da região anterior do braço, e as amostras foram misturadas com anticoagulante citrato de sódio a 3,2% na proporç.......

Representative Results

O tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV foi medido usando um analisador de método viscoelástico para medir o tempo de coagulação do plasma. A máquina é composta por quatro componentes principais: um conversor eletrônico de sinais, uma sonda, um tanque de detecção e um elemento de aquecimento (Figura 1A,B). A sonda utiliza oscilações de alta frequência e baixa amplitude para detectar mudanças na viscosidade do plasma. O controle de qualidade diári.......

Discussion

Neste estudo, a preparação de plasma rico em EV foi descrita, e a racionalidade do método foi verificada por citometria de fluxo. Posteriormente, as amostras de plasma recalcificadas foram analisadas quanto ao tempo de TCA utilizando um analisador de coágulos baseado nos princípios de viscoelasticidade24. Como mostrado na Figura 3A, a concentração de EVs obtidos por ultracentrifugação encurtou o tempo de EV-ACT, enquanto o sobrenadante após ultracentrifugaç.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, bolsa nº 81930031, 81901525. Além disso, agradecemos a Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. por nos fornecer máquinas e orientação técnica.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USAFor quantitative detection of MP
Calcium chlorideWerfen (china)002000680020 mM
Century Clot analyzerTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdThe principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cupTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometerBD, USAUsed to detect MP
Megamix polystyrene beadsBiocytex, Marseille, France7801The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.

References

  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic ....

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