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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui forniamo un protocollo completo per standardizzare e implementare il metodo per rilevare il virus SARS-CoV-2 in campioni umani mediante amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo, eseguito entro 60 minuti, potrebbe essere adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose.

Abstract

Il virus della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha avuto un impatto drammatico sulla salute umana. Continua a essere una minaccia per la società moderna perché molte persone muoiono a causa dell'infezione. La malattia viene diagnosticata utilizzando test sierologici e molecolari, come la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Quest'ultimo presenta diversi svantaggi perché richiede infrastrutture specializzate, attrezzature costose e personale qualificato. Qui, presentiamo un protocollo che delinea i passaggi necessari per rilevare il virus SARS-CoV-2 utilizzando l'amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP) in campioni umani. Il protocollo include istruzioni per la progettazione di primer in silico, la preparazione dei reagenti, l'amplificazione e la visualizzazione. Una volta standardizzato, questo metodo può essere facilmente implementato e adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura entro 60 minuti a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose. È adattabile al rilevamento di diversi agenti patogeni. Pertanto, può potenzialmente essere utilizzato sul campo e nei centri sanitari per effettuare una sorveglianza epidemiologica tempestiva.

Introduction

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Il 30 gennaio 2020 l'Organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato un'emergenza sanitaria pubblica di rilevanza internazionale e l'11 marzo 2020 una pandemia. La pandemia ha provocato oltre 760 milioni di casi e 6,87 milioni di decessi alla data di stesura di questo articolo1.

L'impatto di questo virus ha evidenziato la necessità di strumenti di sorveglianza migliori, più accurati, più veloci e più ampiamente disponibili per migliorare l'individuazione e il controllo delle malattie infettive

Protocol

I campioni utilizzati sono stati forniti dal laboratorio clinico dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili e corrispondevano all'RNA purificato di pazienti risultati positivi al COVID-19 utilizzando la tecnica RT-qPCR. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per la ricerca e questo studio è stato approvato dal comitato bioetico per gli studi sull'uomo dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili.

1. Progettazione e preparazione del primer RT-LAMP

Representative Results

L'implementazione del protocollo inizia con la progettazione del set di primer per ciascun gene bersaglio seguendo il protocollo sopra descritto. Nel giugno 2020, 5.000 genomi di SARS-CoV-2 sono stati ottenuti dal database NextStrain, con una rappresentatività del 10% dei genomi colombiani. Queste sequenze sono state allineate per ottenere la sequenza di consenso utilizzata nel processo di progettazione del primer. La tabella 1 mostra il set di primer scelto per i primer RdRp/Hel e RdRp. Il set di prime.......

Discussion

Sebbene l'RT-LAMP sia considerato una metodologia complementare per l'esecuzione della diagnostica molecolare, presenta anche alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere considerati quando il protocollo viene standardizzato e implementato.

La standardizzazione LAMP per la rilevazione di SARS-CoV-2 ha valutato i seguenti parametri e componenti nella miscela master: (a) concentrazione e temperatura di allineamento dei primer; b) concentrazione degli enzimi; c) concentrazione di magne.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal Sistema General de Regalías della Colombia, sovvenzione numero BPIN 2020000100092, e dall'Universidad Icesi - Convocatoria Interna, sovvenzione numero CA0413119. MFVT è stato finanziato anche dai fondi per le cattedre assistenziali dell'Universidad de los Andes. Gli enti finanziatori non hanno partecipato alla progettazione, all'esecuzione delle attività, alla raccolta dei dati, all'analisi dei dati e alla preparazione del manoscritto. Ringraziamo l'Ospedale Universitario Fundación Valle del Lili per l'RNA virale da campioni di Sars-CoV-2 e il Dr. Alvaro Barrera-Ocampo per i commenti sul manoscritto.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb DNA LadderSOLIS BIODYNE07-12-00050Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis BufferThermoScientificB49Store at roome temperature
Accuris High Fidelity PolymeraseACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTSPR1000-HF-200It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
AgarosePanReacAppliChemA8963,0100N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mLNew England BioLabsM0374S/M0374LFor the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution SetNew England BioLabsN0446SStore at -20 °C
Diethyl pyrocarbonateSigma-Aldrich159220-25G Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-useThermoScientificSM0322Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium saltSanta Cruz Biotechnologysc-215156BN/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL New England BioLabsM0491S/M0491LFor the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mLNew England BioLabsM0380S/M0380LFor the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.

References

  1. World Health Organization. . Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , (2023).
  2. Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Pu....

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Parole chiave SARS CoV 2Trascrizione inversaAmplificazione isotermica mediata da loop RT LAMPCRISPR CasDiagnostica molecolareRilevamento di agenti patogeniTest sul campoPoint of careLow costInibitori di origine vegetale

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