Обнаружение вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции

Summary

Здесь мы предоставляем полный протокол для стандартизации и реализации метода обнаружения вируса SARS-CoV-2 в образцах человека с помощью изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредованной петлей (RT-LAMP). Этот метод, выполненный в течение 60 минут, может быть адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи по низкой цене и с использованием недорогого оборудования.

Abstract

Вирус тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) оказал серьезное воздействие на здоровье человека. Она продолжает оставаться угрозой для современного общества, потому что многие люди умирают в результате инфекции. Заболевание диагностируется с помощью серологических и молекулярных тестов, таких как золотой стандарт полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР). Последний имеет ряд недостатков, поскольку требует специализированной инфраструктуры, дорогостоящего оборудования и обученного персонала. В этой статье мы представляем протокол, в котором изложены шаги, необходимые для обнаружения вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) в образцах человека. Протокол включает в себя инструкции по проектированию праймеров in silico, приготовлению реагентов, амплификации и визуализации. После стандартизации этот метод может быть легко внедрен и адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи в течение 60 минут по низкой цене и с использованием недорогого оборудования. Он приспосабливается к обнаружению различных патогенов. Таким образом, он потенциально может быть использован в полевых условиях и в медицинских центрах для проведения своевременного эпидемиологического надзора.

Introduction

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) вызывает коронавирусную инфекцию 2019 года (COVID-19). 30 января 2020 г. Всемирная организация здравоохранения объявила чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения, имеющую международное значение, а 11 марта 2020 г. – пандемию. На момент написания этой статьи пандемия привела к более чем 760 миллионам случаев заболевания и 6,87 миллионам смертей¹.

Воздействие этого вируса высветило необходимость в более совершенных, точных, быстрых и широко доступных инструментах эпиднадзора для улучшения выявления инфекционных заболеваний и борьбы ....

Protocol

Используемые образцы были предоставлены клинической лабораторией университетской больницы Fundación Valle del Lili и соответствовали очищенной РНК пациентов с положительным результатом теста на COVID-19 с использованием метода ОТ-кПЦР. Все пациенты дали информированное согласие на проведение ис.......

Discussion

Несмотря на то, что RT-LAMP рассматривается как дополнительная методология для выполнения молекулярной диагностики, она также имеет некоторые ограничения и критические шаги, которые необходимо учитывать при стандартизации и внедрении протокола.

В рамках стандартизации LAM.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.