Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

Summary

Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1^B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Abstract

Doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), e distúrbios celulares, como o câncer, são alguns dos distúrbios que interrompem o metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais. As mitocôndrias são organelas que controlam tanto o metabolismo energético quanto os processos celulares envolvidos na sobrevivência e morte celular. Por esta razão, abordagens para avaliar a função mitocondrial podem oferecer informações importantes sobre as condições celulares em processos patológicos e fisiológicos. Nesse sentido, protocolos de respirometria de alta resolução (HRR) permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos. Além disso, o estudo da fisiologia mitocondrial e da bioenergética requer modelos geneticamente e experimentalmente tratáveis, como Drosophila melanogaster.

Esse modelo apresenta várias vantagens, como sua semelhança com a fisiologia humana, seu rápido ciclo de vida, fácil manutenção, custo-benefício, alta capacidade de rendimento e um número minimizado de preocupações éticas. Esses atributos coletivamente o estabelecem como uma ferramenta inestimável para dissecar processos celulares complexos. O presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial utilizando o mutante Drosophila melanogaster ^{PINK1 B9-null}. O gene pink1 é responsável por codificar a putativa quinase 1 induzida por PTEN, através de um processo reconhecido como mitofagia, que é crucial para a remoção de mitocôndrias disfuncionais da rede mitocondrial. Mutações nesse gene têm sido associadas a uma forma familiar autossômica recessiva de início precoce da DP. Esse modelo pode ser utilizado para estudar as disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia da DP.

Introduction

As mitocôndrias são organelas celulares que controlam funções importantes, incluindo regulação apoptótica, homeostase do cálcio e participação em vias biossintéticas. Por possuírem material genético autônomo, são capazes de contribuir para os processos de manutenção e reparo celular. Sua estrutura abriga a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa, ambas cruciais para a energia celular ^1,2,3. Em particular, o controle energético é obtido através da produção de adenosina trifosfato (ATP) via fosforilação oxidativa (OXPHOS)². A interrup....

Protocol

Foram utilizadas as cepas w¹¹¹⁸ (branca) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referida como Pink1^B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) do centro de estoque Bloomington Drosophila (número de identificação: 34749). Neste estudo, mutantes machos de D. melanogaster^{PINK1 B9-null} são comparados com machos de D. melanogaster da cepa w¹¹¹⁸, que é usada como grupo controle (background genético). Outros parâmetros devem ser analisados c.......

Discussion

A HRR é uma técnica poderosa para estudar a respiração mitocondrial e o metabolismo energético em D. melanogaster e outros organismos. Ele fornece uma avaliação detalhada e quantitativa da função mitocondrial, permitindo que os pesquisadores obtenham informações sobre a bioenergética das células. O protocolo aqui apresentado descreve a avaliação da função da cadeia respiratória mitocondrial e da atividade de complexos mitocondriais específicos utilizando o protocolo SUIT em D. melanogaster.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar	Kasv	K25-1800	For bacteriologal use
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118			Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder
GraphPad Prism version 8.0.1.			Software for data acquisition and analysis
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate	Sigma-Aldrich	M1296	Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate	Sigma-Aldrich	S 2378	Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	CAS number 107-35-7