Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем протокол респирометрии высокого разрешения для анализа биоэнергетики у мутантных плодовых мушек PINK1B9-null. В методе используется протокол SUIT (субстрат-разветвитель-ингибитор-титрование).

Abstract

Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона (БП), и клеточные нарушения, такие как рак, являются одними из расстройств, которые нарушают энергетический метаболизм с нарушением функций митохондрий. Митохондрии — это органеллы, которые контролируют как энергетический обмен, так и клеточные процессы, участвующие в выживании и гибели клеток. По этой причине подходы к оценке функции митохондрий могут дать важную информацию о клеточных состояниях при патологических и физиологических процессах. В связи с этим протоколы респирометрии высокого разрешения (HRR) позволяют оценить всю функцию дыхательной цепи митохондрий или активность специфических митохондриальных комплексов. Кроме того, изучение физиологии митохондрий и биоэнергетики требует генетически и экспериментально управляемых моделей, таких как Drosophila melanogaster.

Эта модель имеет ряд преимуществ, таких как сходство с физиологией человека, быстрый жизненный цикл, простота обслуживания, экономичность, высокая пропускная способность и минимальное количество этических проблем. Эти свойства в совокупности делают его бесценным инструментом для анализа сложных клеточных процессов. В настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию с использованием мутанта Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Ген pink1 отвечает за кодирование PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 посредством процесса, известного как митофагия, который имеет решающее значение для удаления дисфункциональных митохондрий из митохондриальной сети. Мутации в этом гене были связаны с аутосомно-рецессивной ранней семейной формой болезни Паркинсона. Данная модель может быть использована для изучения митохондриальной дисфункции, участвующей в патофизиологии болезни Паркинсона.

Introduction

Митохондрии — это клеточные органеллы, которые контролируют важные функции, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и участие в биосинтетических путях. Обладая автономным генетическим материалом, они способны вносить свой вклад в процессы поддержания и восстановления клеток. В их структуре находятся цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование, которые имеют решающее значение для клеточной энергии 1,2,3. В частности, энергетический контроль достигается за счет производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS)

Protocol

Мы использовали штаммы w1118 (белый) и w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (называемый Pink1B9) (идентификатор FlyBase: FBgn0029891) из Блумингтонского центра дрозофилы (идентификационный номер: 34749). В данном исследовании мужские мутанты D. melanogaster PINK1B9-null сравниваются с самцами D. mela.......

Representative Results

Здесь мы видим, что потокO2 в состояниях OXPHOS CI (P = 0,0341) и OXPHOS CI&II (P = 0,0392) уменьшается у нулевых мух PINK1B9 по сравнению с контрольными мухами (рис. 4). Этот результат также наблюдался в предыдущих результатах нашей группы29,30<.......

Discussion

HRR является мощным методом изучения митохондриального дыхания и энергетического обмена у D. melanogaster и других организмов. Он обеспечивает детальную и количественную оценку митохондриальной функции, позволяя исследователям получить представление о биоэнергетике клеток. Представле.......

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность бразильскому агентству Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) и T.D. (#88887.512883/2020-00) являются получателями исследовательских стипендий.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigma-AldrichA5285Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
ÁgarKasvK25-1800For bacteriologal use
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7030Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab softwareOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software for data acquisition and analysis
DigitoninSigma-AldrichD 5628CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTASigma-AldrichE8145Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1.Software for data acquisition and analysis
HepesSigma-AldrichH40344-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Startup O2K respirometer kit
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
MalateSigma-AldrichM1296Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acidSigma-AldrichM1000(S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MESSigma-AldrichM36712-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubesEppendorf
O2K-Titration SetOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Hamilton syringes with different volumes
OligomycinSigma-AldrichO 4876Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
PyruvateSigma-AldrichP2256Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
SuccinateSigma-AldrichS 2378Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
SucroseMerck107,651,000Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
TaurineSigma-AldrichT0625CAS number 107-35-7

References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitoch....

Explore More Articles

201Drosophila melanogaster

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved