Анализ митохондриальной функции у PINK1B9-нулевого мутанта Drosophila melanogaster с использованием респирометрии высокого разрешения

Summary

Здесь мы представляем протокол респирометрии высокого разрешения для анализа биоэнергетики у мутантных плодовых мушек PINK1^B9-null. В методе используется протокол SUIT (субстрат-разветвитель-ингибитор-титрование).

Abstract

Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона (БП), и клеточные нарушения, такие как рак, являются одними из расстройств, которые нарушают энергетический метаболизм с нарушением функций митохондрий. Митохондрии — это органеллы, которые контролируют как энергетический обмен, так и клеточные процессы, участвующие в выживании и гибели клеток. По этой причине подходы к оценке функции митохондрий могут дать важную информацию о клеточных состояниях при патологических и физиологических процессах. В связи с этим протоколы респирометрии высокого разрешения (HRR) позволяют оценить всю функцию дыхательной цепи митохондрий или активность специфических митохондриальных комплексов. Кроме того, изучение физиологии митохондрий и биоэнергетики требует генетически и экспериментально управляемых моделей, таких как Drosophila melanogaster.

Эта модель имеет ряд преимуществ, таких как сходство с физиологией человека, быстрый жизненный цикл, простота обслуживания, экономичность, высокая пропускная способность и минимальное количество этических проблем. Эти свойства в совокупности делают его бесценным инструментом для анализа сложных клеточных процессов. В настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию с использованием мутанта Drosophila melanogaster PINK1^B9-null. Ген pink1 отвечает за кодирование PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 посредством процесса, известного как митофагия, который имеет решающее значение для удаления дисфункциональных митохондрий из митохондриальной сети. Мутации в этом гене были связаны с аутосомно-рецессивной ранней семейной формой болезни Паркинсона. Данная модель может быть использована для изучения митохондриальной дисфункции, участвующей в патофизиологии болезни Паркинсона.

Introduction

Митохондрии — это клеточные органеллы, которые контролируют важные функции, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и участие в биосинтетических путях. Обладая автономным генетическим материалом, они способны вносить свой вклад в процессы поддержания и восстановления клеток. В их структуре находятся цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование, которые имеют решающее значение для клеточной энергии ^1,2,3. В частности, энергетический контроль достигается за счет производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS)

Protocol

Мы использовали штаммы w¹¹¹⁸ (белый) и w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (называемый Pink1^B9) (идентификатор FlyBase: FBgn0029891) из Блумингтонского центра дрозофилы (идентификационный номер: 34749). В данном исследовании мужские мутанты D. melanogaster PINK1^B9-null сравниваются с самцами D. mela.......

Discussion

HRR является мощным методом изучения митохондриального дыхания и энергетического обмена у D. melanogaster и других организмов. Он обеспечивает детальную и количественную оценку митохондриальной функции, позволяя исследователям получить представление о биоэнергетике клеток. Представле.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar	Kasv	K25-1800	For bacteriologal use
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118			Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder
GraphPad Prism version 8.0.1.			Software for data acquisition and analysis
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate	Sigma-Aldrich	M1296	Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate	Sigma-Aldrich	S 2378	Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	CAS number 107-35-7