Esplorazione degli effetti indipendenti dell'ormone follicolo-stimolante in vivo in un modello murino

Summary

L'ormone follicolo-stimolante (FSH) in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Il modello murino ovariectomizzato e trattato con FSH (OVF) può essere utilizzato per esplorare le azioni extragonadiche di FSH.

Abstract

Durante il passaggio da una fase riproduttiva a una non riproduttiva (menopausa), molte donne sperimentano significativi cambiamenti fisiologici e patologici, tra cui la diminuzione della massa ossea, l'aumento dei lipidi nel sangue e l'aumento dell'adiposità viscerale. I livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH) aumentano durante la transizione della menopausa. Molti studi hanno dimostrato che l'FSH in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante. In questo studio, topi femmina C57BL/6 sono stati ovariectomizzati e completati con estradiolo valerato (OVX + E2) per eliminare l'effetto dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. I topi OVX + E2 hanno ricevuto solvente (N.S.) o diverse dosi di FSH ricombinante tramite iniezione intraperitoneale per creare un modello murino (OVF) caratterizzato da estrogeni relativamente stabili e livelli crescenti di FSH. Pertanto, abbiamo generato con successo un modello murino sperimentale per imitare la fase iniziale della transizione della menopausa, caratterizzata da elevati livelli sierici di FSH. Il modello OVF presenta i vantaggi di essere stabile, a basso costo e facile da usare, il che è adatto per studi volti a esplorare le azioni extragonadiche dell'FSH. Qui descriviamo i protocolli dettagliati per il modello OVF del topo.

Introduction

I livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH) aumentano durante la transizione menopausale (il termine transizione menopausale è stato definito nel 2011 in fase di invecchiamento riproduttivo workshop (STRAW) + 10 system)¹. È durante la transizione della menopausa, un periodo caratterizzato da un aumento dei livelli di FSH e da una posizione relativamente stabile di estrogeni¹, che le donne sperimentano cambiamenti del ciclo mestruale e cambiamenti fisiologici significativi che coinvolgono varie cellule e tessuti. Questi cambiamenti possono influire seriamente sulla qualità della vita e sulla salute delle donne. Esplorare gli effetti dell'FSH può migliorare la qualità della vita e la salute delle donne.

L'FSH è secreto dalle cellule gonadotrope dell'ipofisi anteriore ed è fondamentale per controllare la funzione gonadica e la riproduzione². La funzione dell'FSH è mediata dal recettore dell'FSH (FSHR), che appartiene al recettore accoppiato alla proteina G (GPCR)³. La FSHR è generalmente espressa nelle gonadi, vale a dire l'ovaio e il testicolo. È stato dimostrato che la FSHR è universalmente espressa in più cellule e tessuti extragonadici, tra cui fegato⁴, ippocampo⁵, osteoclasti⁶, adipociti⁷ e cellule endoteliali⁸. Studi emergenti hanno rivelato azioni gonadiche extra di FSH e la sua potenziale rilevanza clinica nella dislipidemia⁴, nel morbo di Alzheimer⁵, nell'osteoporosi ^9,10, nell'aterosclerosi¹¹, nell'obesità⁹ e nel cancro¹². Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante per esplorare le azioni del solo FSH.

Nel protocollo, abbiamo introdotto la procedura per stabilire un modello murino con estrogeni relativamente stabili e livelli crescenti di FSH¹³. Il modello murino imita la transizione della menopausa mediante chirurgia ovariectomizzata e quindi integrato con estradiolo valerato e FSH ricombinante. Poiché i topi ovariectomizzati sono stati integrati con estrogeni esogeni per mantenere livelli di estrogeni simili con i topi operati fittizi, i livelli di FSH endogeno erano stabili a causa del feedback degli estrogeni alla ghiandola pituitaria. In questa condizione, potrebbe controllare i livelli di FSH somministrando FSH esogeno senza alterare i livelli di estrogeni. Pertanto, il modello murino OVF può escludere l'influenza degli estrogeni e osservare gli effetti fisiologici e patologici extragonadici di FSH. Riteniamo che la procedura dettagliata e visualizzata sia utile ai ricercatori per stabilire il modello murino OVF nel loro laboratorio e applicarlo per studiare i cambiamenti fisiologici e patologici durante la transizione della menopausa, se necessario.

Protocol

Il seguente protocollo è conforme a tutte le linee guida etiche istituzionali relative all'uso di animali da ricerca ed è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali dell'Ospedale Provinciale di Shandong, in Cina. Tutte le manipolazioni chirurgiche sono state eseguite in anestesia profonda e gli animali non hanno avvertito dolore in nessuna fase della procedura.

1. Preparazione pre-operatoria

1. Sterilizzazione degli strumenti
   1. Sterilizzare a vapore gli strumenti chirurgici in autoclave (121°C per 15 minuti) prima dell'intervento. Preparare una quantità sufficiente di suture e aghi monouso.
2. Configurazione della piattaforma chirurgica
   1. Eseguire l'intervento in una sala dedicata alle procedure chirurgiche. Assegnare un'area del banco di almeno 60 cm x 60 cm per l'operazione. Pulire la superficie dell'area con alcol al 75% e coprirla con un asciugamano medico monouso, quindi disinfettarla con radiazioni ultraviolette con 30 minuti di anticipo (Figura 1A).
3. Preparazione degli animali
   1. Alloggiare tutti gli animali in una stanza a temperatura controllata (20-25 °C) con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Acclimatare topi femmina C57BL/6 di 8 settimane alla struttura di stabulazione per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico.
   2. Pesare i topi prima dell'intervento. Somministrare a tutti i topi femmine di 9 settimane in anestesia generale mediante iniezione intraperitoneale di tricromoetanolo (280 mg/kg), per ottenere l'indolore in qualsiasi fase della procedura. Iniettare meloxicam (2 mg/kg) per via sottocutanea, circa 1 ora prima dell'operazione per alleviare il dolore.
   3. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza corneale durante l'intervento chirurgico.
   4. Applicare la lozione depilatoria sulla schiena utilizzando un batuffolo di cotone pulito. Lascia agire la lozione su un topo per 3-5 minuti, quindi rimuovi i peli usando garza e cotton fioc. Ripeti questo passaggio fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dal retro del mouse.
   5. Usa garze e cotton fioc per pulire la pelle con alcol al 75%. Fissare il mouse sulla piattaforma chirurgica utilizzando una striscia di gomma o una corda di cotone (Figura 1B) e applicare una soluzione di iodoforo per pulire la schiena.
      NOTA: Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando un dito del piede prima dell'ovariectomia.

2. Ovariectomia

NOTA: Il tricromoetanolo può essere mantenuto per circa 30 minuti, assicurando che l'intervento chirurgico sia completato il più possibile.

1. Praticare un'incisione dorsale di ~1,0 cm longitudinalmente dalla base della coscia verso l'alto utilizzando un bisturi monouso, assicurandosi che solo la pelle e la fascia sottocutanea siano incise ed evitando di tagliare il peritoneo posteriore in questo momento.
2. Tira l'incisione verso sinistra e si può vedere un cuscinetto di grasso bianco. Tagliare ~0,5 cm lungo il cuscinetto di grasso bianco per esporre la cavità intraperitoneale utilizzando micro-pinze e forbici.
3. Dopo aver tagliato il peritoneo posteriore, rimuovere lentamente e delicatamente il cuscinetto adiposo bianco dalla cavità intraperitoneale con una micro-pinza. Inumidire immediatamente il tessuto adiposo bianco con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% al di fuori della garza imbevuta. Mantenere il tessuto esposto sempre inumidito mentre si trova all'esterno della cavità addominale.
4. Una sostanza granulare rosa, ovvero l'ovaio, è attaccata alla parte inferiore del cuscinetto adiposo bianco (Figura 2A). Le ovaie sono collegate a un dotto sottile, ovvero l'utero. Utilizzare punti di sutura riassorbibili 5-0 per legare l'estremità ovarica dell'utero e rimuovere l'ovaio sinistro (Figura 2B).
5. Quando si rimuove un'ovaia, preservare il più possibile il tessuto adiposo circostante. Evitare il contatto diretto tra gli strumenti chirurgici e le ovaie e prevenire l'impianto intraperitoneale del tessuto ovarico.
6. Riposizionare con cautela il cuscinetto di grasso bianco nella cavità intraperitoneale. Eseguire una semplice sutura intermittente sul peritoneo posteriore con una sutura assorbibile 5-0 (Figura 2C). Al termine della sutura, pulire l'eventuale sanguinamento con una garza sterile imbevuta di soluzione salina allo 0,9%.
7. Tira l'incisione cutanea verso destra e rimuovi l'ovaio destro usando lo stesso metodo.
8. Eseguire una sutura intermittente con suture 4-0 non assorbibili e pulire eventuali perdite di sangue con una garza sterile imbevuta di soluzione salina allo 0,9% (Figura 2D).
9. Pulire la ferita con una soluzione iodofora dopo aver completato entrambe le suture. Iniettare antibiotici ad ampio spettro per via intraperitoneale.

3. Osservazione post-operatoria

1. Spostare i topi in una coperta a temperatura costante di 37 °C dopo l'intervento. Fino a quando i topi non saranno in grado di muoversi liberamente, tieni gli animali nella loro gabbia individuale. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza a sufficienza per mantenere la decubito sternale.
2. Iniettare meloxicam (2 mg/kg) per via sottocutanea 24 ore dopo l'operazione per alleviare il dolore.
3. Monitorare quotidianamente i topi per assicurarsi che la ferita chirurgica guarisca correttamente senza che siano presenti segni di complicanze (deiscenza).

4. Integrazione di estradiolo

1. Preparare il mangime integrato con estradiolo valerato. Utilizzare 2,6 mg di beta-estradiolo 17-valerato integrato per 1 kg di mangime.
2. A 3 giorni dal completamento dell'intervento chirurgico, nutrire i topi con estradiolo valerato.

5. Iniezione di FSH

1. Preparare una soluzione di FSH umano ricombinante. Sciogliere la polvere di FSH umano ricombinante per iniezione con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% a 100 UI/mL.
2. Raggruppare i topi secondo i piani sperimentali e somministrare solvente o diverse dosi di FSH ricombinante tramite iniezione intraperitoneale per 2 settimane. In base all'attività biologica dell'FSH ricombinante, utilizzare la dose iniettabile di FSH nei topi equivalente al livello sierico di FSH nelle donne durante il periodo di transizione della menopausa.
   NOTA: Sulla base di diversi trattamenti, i topi ovariectomizzati con estrogeni sono stati divisi in modo casuale in tre gruppi, gruppo solvente (NS) che ha ricevuto 100 μL/die solvente, gruppo FSH A BASSO DOSAGGIO (L-FSH) che ha ricevuto 15 UI/kg di peso corporeo al giorno e gruppo FSH ad alte dosi (H-FSH) che ha ricevuto 30 UI/kg di peso corporeo al giorno.

Discussion

Durante il passaggio da una fase riproduttiva a una non riproduttiva (menopausa), molte donne sperimentano significativi cambiamenti fisiologici e patologici. I livelli di FSH aumentano durante la transizione menopausale¹. Studi emergenti hanno rivelato che l'FSH in vari tessuti e organi extragonadici è fondamentale nella patogenesi di molteplici malattie, tra cui la dislipidemia⁴, il morbo di Alzheimer⁵, l'osteoporosi ^9,10, l'aterosclerosi¹¹, l'obesità⁹ e il cancro¹². Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante. Il modello murino OVF imita la fase iniziale della transizione alla menopausa con estrogeni relativamente stabili e livelli di FSH in aumento ed è particolarmente adatto per studi volti a esplorare le azioni extragonadiche di FSH.

In questo metodo, l'ovariectomia è stata eseguita utilizzando una singola incisione dorsale posteriore, a circa 1 cm dalla base della coscia verso l'alto (Figura 1B). La pelle è stata tagliata quasi insieme ai muscoli dorsali utilizzando forbici da dissezione affilate, e si è così acceduto alla cavità peritoneale. Dopo l'operazione, l'incisione muscolare non ha richiesto sutura e la ferita cutanea è stata chiusa bilateralmente con una sutura catgut (Figura 2). L'operazione è tecnicamente più semplice, meno dispendiosa in termini di tempo e meno dannosa per i topi femmina rispetto ad altri metodi utilizzati.

Alcuni dettagli che dovrebbero essere curati durante la procedura chirurgica. In primo luogo, tutte le procedure chirurgiche devono essere mantenute pulite e il più sterili possibile per ridurre il rischio di infezione postoperatoria. In secondo luogo, poiché il tessuto ovarico è molto fragile, gli strumenti chirurgici non possono entrare in contatto diretto con le ovaie durante l'ovariectomia, per evitare l'impianto intraperitoneale. In terzo luogo, dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati spostati in una coperta a temperatura costante di 37 °C durante il recupero per prevenire l'ipotermia postoperatoria che portava alla morte.

Uno studio precedente ha dimostrato che gli estrogeni endogeni sono sintetizzati nelle cellule teche ovariche delle donne in premenopausa o nelle cellule stromali adipose del seno delle donne in postmenopausa e in quantità minori nel tessuto periferico¹⁴. Gli estrogeni sierici sono diminuiti bruscamente per i topi ovariectomizzati, ma non possono essere eliminati (Figura 3B). Tuttavia, gli estrogeni endogeni sintetizzati nel tessuto extragonadico non influenzano la stabilità dei livelli di estrogeni nel modello OVF (Figura 4B).

Il modello OVF presenta alcune limitazioni. Una volta che l'operazione chirurgica non è attenta e porta all'impianto intraperitoneale ovarico, può portare al fallimento del modello. In questo caso, l'estrogeno sierico non diminuisce bruscamente e fluttua durante le diverse fasi del ciclo estrale. Dopo la somministrazione esogena di estrogeni e FSH, ci vuole circa 1 settimana perché il corpo raggiunga l'equilibrio. Pertanto, i cambiamenti patologici del modello OVF che si verificano entro 1 settimana non possono indicare gli effetti dell'FSH.

In conclusione, il modello OVF ha il vantaggio di essere stabile, a basso costo e facile da usare. Gli effetti sistemici di FSH ad alti livelli possono essere osservati dopo l'iniezione intraperitoneale di FSH; cioè, il modello OVF è adatto per studi che esplorano le azioni extragonadiche di FSH. Tuttavia, i requisiti per la chirurgia del modello e le procedure di iniezione intraperitoneale sono piuttosto elevati. Se il finanziamento è sufficiente, i modelli specifici di knockout sono la scelta migliore.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
beta-estradiol 17-valerate	Macklin	E829824
Estradiol sensitive ELISA	Demeditec	DE4399
Hematoxylin Staining Solution	Beyotime	C0107
Meloxicam	Aladdin	M129228
recombinant human Follicle-stimulating hormone	Merck Serono	N19Z8803G
Tribromoethanol	Sigma	T48402	Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol