Knockdown di FAM83A per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino

Summary

Qui, mostriamo le procedure per l'abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.

Abstract

L'esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell'identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l'espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all'apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l'intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.

Introduction

Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne¹. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli². Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del coll....

Protocol

Lo studio è stato completamente conforme alle linee guida di pubblicazione fornite dal TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Fonte dei dati e analisi bioinformatica

1. Ottieni i dati di sequenziamento dell'RNA dal database Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) per l'analisi dei .......

Discussion

Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l'identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l'uso dell'analisi d.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0