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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui, mostriamo le procedure per l'abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.

Abstract

L'esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell'identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l'espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all'apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l'intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.

Introduction

Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne1. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli2. Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del coll....

Protocol

Lo studio è stato completamente conforme alle linee guida di pubblicazione fornite dal TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Fonte dei dati e analisi bioinformatica

  1. Ottieni i dati di sequenziamento dell'RNA dal database Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) per l'analisi dei .......

Representative Results

Analisi del database TCGA e validazione PCR

Dall'analisi del database TCGA, abbiamo condotto un'analisi comparativa dei livelli di espressione dell'mRNA in 306 campioni di cellule di cancro cervicale e 13 campioni di cellule normali per studiare l'espressione differenziale di FAM83A. FAM83A è stato sovraregolato nel cancro cervicale, mentre la sua espressione nel tessuto cervicale normale era .......

Discussion

Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l'identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l'uso dell'analisi d.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (n. 2020HC06).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells and Medium Formulation
C33aAmerican Type Culture Collection
HelaAmerican Type Culture Collection
Modified medium10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT4691, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Bcl2 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:1,000
Caspase 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:2,000
cleaved-caspase3abs132005; Absin Bioscience Inc.‘1:1,000
Cytc10993-1-AP; Proteintech Group‘1:1,000
GAPDH 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.‘1:8,000
mTOR2983, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
PI3K4292, Cell Signaling Technology Inc‘1:1,000
p-AKT 4060, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit17366, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Secondary antibodiesGB23303, Servicebio‘1:2,000
Materials
6-well plateCorning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
BCA Protein assay kit Beyotime, China P0011
ChemiDoc XRS Imager System BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit Servicebio, Inc.,Chinacat. no. G2014
Fluorescence microscope Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit Beyotime, China
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China#ST506
Real-time quantitative PCR instrument Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagentInvitrogen15596026
TRIzol reagent Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro plus 6.0  

References

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer.

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