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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, mostramos os procedimentos para knockdown do FAM83A ; os ensaios para detectar seus efeitos sobre a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical; e a sensibilização dessas células à cisplatina. Este estudo fornece um gene alvo promissor para o câncer cervical e uma referência para futuras pesquisas de drogas.

Abstract

A exploração de genes-alvo tumorais é de suma importância para a prevenção e tratamento do câncer cervical. Neste estudo, descrevemos as etapas envolvidas na identificação de um gene alvo tumoral FAM83A no câncer cervical. Primeiro, o conjunto de dados do Atlas do Genoma do Câncer foi empregado para validar a expressão e o significado prognóstico de FAM83A em mulheres. Um pequeno RNA de interferência (siRNA) foi usado para knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . Em seguida, a coloração de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi conduzida para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação das células tumorais. Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa foram realizados para avaliar a capacidade de migração e invasão de células tumorais.

Western blotting foi usado para quantificar os níveis de proteína relacionada à apoptose. A coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Além disso, a intervenção com cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP) foi utilizada para avaliar o potencial terapêutico do gene alvo. Citometria de fluxo e ensaios de formação de colônias foram conduzidos para validar ainda mais as características anticâncer do gene. Como resultado, o knockdown de FAM83A mostrou inibir a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical e sensibilizar essas células à cisplatina. Essas metodologias abrangentes validam coletivamente o FAM83A como um gene-alvo associado ao tumor, sendo promissor como um alvo terapêutico potencial na prevenção e tratamento do câncer cervical.

Introduction

O câncer do colo do útero é uma preocupação mundial, pois é um dos principais tipos de neoplasia ginecológica no mundo e é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer emmulheres1. A cirurgia radical e a quimiorradioterapia estão associadas a altas taxas de cura no estágio primário. No entanto, os resultados do tratamento para pacientes em estágio avançado de câncer de colo uterino que desenvolvem doença metastática são muito desfavoráveis2. Portanto, é crucial compreender melhor os mecanismos biológicos subjacentes à migração e invasão de células cancerosas do colo do útero e identificar potenciais alvos terap....

Protocol

O estudo estava completamente de acordo com as diretrizes de publicação fornecidas pelo TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Fonte de dados e análise bioinformática

  1. Obter dados de sequenciamento de RNA do banco de dados (https://cancergenome.nih.gov) do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para a.......

Representative Results

Análise do banco de dados TCGA e validação do PCR

A partir da análise do banco de dados TCGA, realizamos uma análise comparativa dos níveis de expressão de RNAm em 306 amostras de células de câncer cervical e 13 amostras de células normais para investigar a expressão diferencial de FAM83A. O FAM83A foi regulado para cima no câncer cervical, enquanto sua expressão no tecido cervical.......

Discussion

A investigação de genes-alvo tumorais é de extrema importância tanto para a prevenção quanto para o tratamento do câncer cervical. A compreensão dos genes específicos que desempenham um papel significativo no desenvolvimento e progressão do câncer cervical fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes da doença. Além disso, a identificação desses genes-alvo pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e terapias-alvo. Neste estudo, descrevemos o uso da aná.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Departamento de Ciência e Tecnologia de Jingzhou (nº 2020HC06).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells and Medium Formulation
C33aAmerican Type Culture Collection
HelaAmerican Type Culture Collection
Modified medium10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT4691, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Bcl2 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:1,000
Caspase 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:2,000
cleaved-caspase3abs132005; Absin Bioscience Inc.‘1:1,000
Cytc10993-1-AP; Proteintech Group‘1:1,000
GAPDH 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.‘1:8,000
mTOR2983, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
PI3K4292, Cell Signaling Technology Inc‘1:1,000
p-AKT 4060, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit17366, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Secondary antibodiesGB23303, Servicebio‘1:2,000
Materials
6-well plateCorning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
BCA Protein assay kit Beyotime, China P0011
ChemiDoc XRS Imager System BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit Servicebio, Inc.,Chinacat. no. G2014
Fluorescence microscope Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit Beyotime, China
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China#ST506
Real-time quantitative PCR instrument Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagentInvitrogen15596026
TRIzol reagent Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro plus 6.0  

References

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer.

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