A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.
בהשוואה למקבילו בעל פוטון אחד, עירור של שני פוטונים מועיל לניסויי הדמיה ביולוגית בגלל רעילות האור הנמוכה שלו, חדירה עמוקה יותר של רקמות, פעולה יעילה במערכות צפופות ובחירת אור זוויתית מופחתת של פלואורופורים. לפיכך, הכנסת ניתוח קיטוב במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים (2PFM) מספקת קביעה מדויקת יותר של הארגון המולקולרי בדגימה בהשוואה לשיטות הדמיה סטנדרטיות המבוססות על תהליכים אופטיים ליניאריים. בעבודה זו אנו מתמקדים ב-2PFM (ps-2PFM) הרגיש לקיטוב ויישומו בקביעת הסדר המולקולרי בתוך ביו-מבנים מורכבים-עמילואיד ספרוליטים. מחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון מאובחנות לעתים קרובות באמצעות זיהוי של אגרגטים עמילואידים-חלבונים שנוצרו עקב תהליך קיפול שגוי של חלבון. חקירת המבנה שלהם מובילה להבנה טובה יותר של מסלול היצירה שלהם וכתוצאה מכך, לפיתוח שיטות אבחון רגישות יותר. מאמר זה מציג את ps-2PFM המותאם לקביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר וצברי חלבונים עמילואידוגניים כדוריים. יתר על כן, אנו מוכיחים כי הטכניקה המוצעת יכולה לפתור את הארגון התלת ממדי של סיבים בתוך הספרוליט.
במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם1, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה 2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי4 שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב3. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואור....
1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ עם ספרוליטים מגודלים במלואם
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. כל התמיסות הוכנו עם מים נטולי יונים, (18.2 MΩ·cm ב-25°C) שהתקבלו ממערכת טיהור המים.
הפרוטוקול המוצג מספק הדרכה שלב אחר שלב באמצעות הכנת מבני על עמילואידיים לבדיקה עם ps-2PFM, בניית המערכת המיקרוסקופית ומדידות של הדגימה המתאימה. אולם לפני סדרת המדידות הסופית, חיוני ליישר כראוי את ה-APDs עם ייחוס איזוטרופי, מה שאמור לגרום לאיסוף אות סימטרי בעל צורה ועוצמה דומות בשני הגלאים (
מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב הוא כלי רב ערך לחקר הסדר המקומי של סיבים בתוך מבני העל של עמילואיד, הדורש רק שינויים קטנים של מערך המולטיפוטונים הסטנדרטי. מכיוון שהוא פועל על תופעות אופטיות לא ליניאריות, ניתן להשיג בחירת צילום זוויתית מופחתת ורזולוציה צירית משופרת בהשוואה לשיטות מיקרו?.......
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט סונטה ביס 9 (2019/34/E/ST5/00276) שמומן על ידי המרכז הלאומי למדע בפולין.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation | |||
Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
Microscope ps-2PFM setup | |||
Chameleon Ultra II | Coherent | ||
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
Software | |||
LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
NumPy library | Version 1.19.2 | ||
SciPy library | Version 1.5.2 | ||
Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved