Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.

Abstract

בהשוואה למקבילו בעל פוטון אחד, עירור של שני פוטונים מועיל לניסויי הדמיה ביולוגית בגלל רעילות האור הנמוכה שלו, חדירה עמוקה יותר של רקמות, פעולה יעילה במערכות צפופות ובחירת אור זוויתית מופחתת של פלואורופורים. לפיכך, הכנסת ניתוח קיטוב במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים (2PFM) מספקת קביעה מדויקת יותר של הארגון המולקולרי בדגימה בהשוואה לשיטות הדמיה סטנדרטיות המבוססות על תהליכים אופטיים ליניאריים. בעבודה זו אנו מתמקדים ב-2PFM (ps-2PFM) הרגיש לקיטוב ויישומו בקביעת הסדר המולקולרי בתוך ביו-מבנים מורכבים-עמילואיד ספרוליטים. מחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון מאובחנות לעתים קרובות באמצעות זיהוי של אגרגטים עמילואידים-חלבונים שנוצרו עקב תהליך קיפול שגוי של חלבון. חקירת המבנה שלהם מובילה להבנה טובה יותר של מסלול היצירה שלהם וכתוצאה מכך, לפיתוח שיטות אבחון רגישות יותר. מאמר זה מציג את ps-2PFM המותאם לקביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר וצברי חלבונים עמילואידוגניים כדוריים. יתר על כן, אנו מוכיחים כי הטכניקה המוצעת יכולה לפתור את הארגון התלת ממדי של סיבים בתוך הספרוליט.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם1, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה 2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי4 שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב3. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואור....

Protocol

1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ עם ספרוליטים מגודלים במלואם

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. כל התמיסות הוכנו עם מים נטולי יונים, (18.2 MΩ·cm ב-25°C) שהתקבלו ממערכת טיהור המים.

  1. לדגור על הספרוליטים העמילו?.......

Representative Results

הפרוטוקול המוצג מספק הדרכה שלב אחר שלב באמצעות הכנת מבני על עמילואידיים לבדיקה עם ps-2PFM, בניית המערכת המיקרוסקופית ומדידות של הדגימה המתאימה. אולם לפני סדרת המדידות הסופית, חיוני ליישר כראוי את ה-APDs עם ייחוס איזוטרופי, מה שאמור לגרום לאיסוף אות סימטרי בעל צורה ועוצמה דומות בשני הגלאים (

Discussion

מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב הוא כלי רב ערך לחקר הסדר המקומי של סיבים בתוך מבני העל של עמילואיד, הדורש רק שינויים קטנים של מערך המולטיפוטונים הסטנדרטי. מכיוון שהוא פועל על תופעות אופטיות לא ליניאריות, ניתן להשיג בחירת צילום זוויתית מופחתת ורזולוציה צירית משופרת בהשוואה לשיטות מיקרו?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט סונטה ביס 9 (2019/34/E/ST5/00276) שמומן על ידי המרכז הלאומי למדע בפולין.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mmChemland04-298.202.04
DPX mountant for histologySigma-Aldrich6522Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropyleneChemland02-63102
Eppendorf ThermoMixer CEppendorfUsed for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification systemHydrolabSource of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),Sigma-Aldrich30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))Sigma-AldrichI5500
Methanol (HPLC grade)Sigma-Aldrich270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mmChemland04-296.202.09
Olympus BX60OlympusPolarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2ChemlandVIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra IICoherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass FilterThorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass FilterThorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nmThorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NANikon
piezo 3D stagePiezosystem Jena
Polarizing BeamsplitterThorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabs
Software
LabView 2018National InstrumentsVersion 18.0.1f2
Matplotlib libraryVersion 3.3.2
NumPy libraryVersion 1.19.2
SciPy libraryVersion 1.5.2
Spyder Python 3 IDEVersion 4.1.5

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein a....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2PFM2PFM ps 2PFM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved