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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Abstract

Ci si aspetta che le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) con capacità infinita di autoproliferazione abbiano applicazioni in numerosi campi, tra cui la delucidazione delle patologie delle malattie rare, lo sviluppo di nuovi farmaci e la medicina rigenerativa che mira a ripristinare gli organi danneggiati. Ciononostante, l'implementazione sociale delle hiPSC è ancora limitata. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di riprodurre la differenziazione in coltura, anche con conoscenze avanzate e sofisticate competenze tecniche, a causa dell'elevata sensibilità delle iPSC ai minimi cambiamenti ambientali. L'applicazione di un sistema di coltura automatizzato può risolvere questo problema. Esperimenti con un'elevata riproducibilità indipendente dall'abilità di un ricercatore possono essere previsti secondo una procedura condivisa tra vari istituti. Sebbene in precedenza siano stati sviluppati diversi sistemi di coltura automatizzati in grado di mantenere le colture di iPSC e indurre la differenziazione, questi sistemi sono pesanti, grandi e costosi perché fanno uso di bracci robotici umanizzati e multi-articolati. Per migliorare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che utilizza un semplice sistema di guide di scorrimento dell'asse x-y-z, che consente di essere più compatto, più leggero e più economico. Inoltre, l'utente può facilmente modificare i parametri nel nuovo sistema per sviluppare nuove attività di movimentazione. Una volta stabilita un'attività, tutto ciò che l'utente deve fare è preparare l'iPSC, fornire in anticipo i reagenti e i materiali di consumo necessari per l'attività desiderata, selezionare il numero dell'attività e specificare l'ora. Abbiamo confermato che il sistema potrebbe mantenere le iPSC in uno stato indifferenziato attraverso diversi passaggi senza cellule feeder e differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, epatociti, progenitori neurali e cheratinociti. Il sistema consentirà esperimenti altamente riproducibili tra le istituzioni senza la necessità di ricercatori qualificati e faciliterà l'implementazione sociale delle hiPSC in una gamma più ampia di campi di ricerca, diminuendo gli ostacoli per i nuovi ingressi.

Introduction

Questo articolo ha lo scopo di fornire procedure di gestione effettive e dettagliate per un sistema di coltura automatizzato per cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), che abbiamo prodotto collaborando con un'azienda, e di mostrare risultati rappresentativi.

Dalla pubblicazione dell'articolo nel 2007, l'iPSC ha attirato l'attenzione di tutto il mondo1. A causa della sua maggiore caratteristica di essere in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica, ci si aspetta che venga applicato in vari campi come la medicina rigenerativa, chiarendo le cause delle malattie intrattabili e sviluppan....

Protocol

Il Comitato Etico dell'Università di Medicina del Kansai ha approvato la generazione e l'uso delle iPSC sane derivate da volontari denominate KMUR001 (approvazione n. 2020197). Il donatore, che è stato reclutato apertamente, ha fornito un consenso informato formale e ha accettato l'uso scientifico delle cellule.

NOTA: L'interfaccia corrente (il software speciale denominato "ccssHMI" in esecuzione con il sistema operativo Windows XP) è la schermata operativa fondamentale. Sotto la suddetta i.......

Representative Results

Mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Abbiamo utilizzato tre linee hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Abbiamo ottimizzato il protocollo di manutenzione attraverso esperimenti giornalieri eseguiti manualmente e ulteriormente ottimizzato i programmi dettagliati attraverso i sette esperimenti preliminari eseguiti dal sistema. Ad esempio, le sollecitazioni di taglio causate dalle velocità del liquido del flusso dello spiedo da diverse pipette maneggiate dall'uomo e dal sistema s.......

Discussion

Un passaggio critico del protocollo è che se un utente rileva errori, fare clic sul pulsante Annulla, Interrompi o Ripristina in qualsiasi momento e ricominciare dal primo passaggio. Il software può evitare errori umani, tra cui la doppia prenotazione, l'apertura delle porte mentre le attività del sistema sono attive e la mancanza di rifornimento. Un altro punto critico per una differenziazione efficace ed efficiente nella cellula somatica desiderata è la corretta selezione delle linee di cellule staminali pluripoten.......

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Giappone.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% bovine serum albumin fraction VFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm plastic plates Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  mouseAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  rabbitDakoA0001
All-trans retinoic acidFuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
Automated culture systemPanasonic
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
Bovine serum albuminMerck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometerCountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum Biowest, FL, United StatesS140T
FGF-basic Nacalai Tesque Inc.19155-07
ForskolinThermo Fisher ScientificJ63292.MF
GlutamineThermo Fisher Scientific25030081Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  goatSantacruz6556
HydrocortisoneThermo Fisher ScientificA16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinateMerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021Cell culture matrix
Insulin-transferrin-seleniumThermo Fisher Scientific41400045
Keratin 1  mouseSantacruz376224
Keratin 10  rabbitBioLegend19054
KMUR001Kansai Medical University Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacementThermo Fisher Scientific10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 medium Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1Acell culture medium 
Oct 3/4  mouseBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
Recombinant human albumin A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN Bioresource Research CenterHPS0014undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
Sodium L-ascorbateMerckA4034-100G
SSEA-4  mouseMilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02cell culture medium 
TnT rabbitAbcamab92546
TRA 1-81 mouseMilliporeMAB4381
TriiodothyronineThermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM express enzyme Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
Trypan blue solution Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
Tryptose phosphate brothMerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-7925 Tublin  mousePromegaG712A

References

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human....

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