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Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.
Ci si aspetta che le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) con capacità infinita di autoproliferazione abbiano applicazioni in numerosi campi, tra cui la delucidazione delle patologie delle malattie rare, lo sviluppo di nuovi farmaci e la medicina rigenerativa che mira a ripristinare gli organi danneggiati. Ciononostante, l'implementazione sociale delle hiPSC è ancora limitata. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di riprodurre la differenziazione in coltura, anche con conoscenze avanzate e sofisticate competenze tecniche, a causa dell'elevata sensibilità delle iPSC ai minimi cambiamenti ambientali. L'applicazione di un sistema di coltura automatizzato può risolvere questo problema. Esperimenti con un'elevata riproducibilità indipendente dall'abilità di un ricercatore possono essere previsti secondo una procedura condivisa tra vari istituti. Sebbene in precedenza siano stati sviluppati diversi sistemi di coltura automatizzati in grado di mantenere le colture di iPSC e indurre la differenziazione, questi sistemi sono pesanti, grandi e costosi perché fanno uso di bracci robotici umanizzati e multi-articolati. Per migliorare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che utilizza un semplice sistema di guide di scorrimento dell'asse x-y-z, che consente di essere più compatto, più leggero e più economico. Inoltre, l'utente può facilmente modificare i parametri nel nuovo sistema per sviluppare nuove attività di movimentazione. Una volta stabilita un'attività, tutto ciò che l'utente deve fare è preparare l'iPSC, fornire in anticipo i reagenti e i materiali di consumo necessari per l'attività desiderata, selezionare il numero dell'attività e specificare l'ora. Abbiamo confermato che il sistema potrebbe mantenere le iPSC in uno stato indifferenziato attraverso diversi passaggi senza cellule feeder e differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, epatociti, progenitori neurali e cheratinociti. Il sistema consentirà esperimenti altamente riproducibili tra le istituzioni senza la necessità di ricercatori qualificati e faciliterà l'implementazione sociale delle hiPSC in una gamma più ampia di campi di ricerca, diminuendo gli ostacoli per i nuovi ingressi.
Questo articolo ha lo scopo di fornire procedure di gestione effettive e dettagliate per un sistema di coltura automatizzato per cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), che abbiamo prodotto collaborando con un'azienda, e di mostrare risultati rappresentativi.
Dalla pubblicazione dell'articolo nel 2007, l'iPSC ha attirato l'attenzione di tutto il mondo1. A causa della sua maggiore caratteristica di essere in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica, ci si aspetta che venga applicato in vari campi come la medicina rigenerativa, chiarendo le cause delle malattie intrattabili e sviluppan....
Il Comitato Etico dell'Università di Medicina del Kansai ha approvato la generazione e l'uso delle iPSC sane derivate da volontari denominate KMUR001 (approvazione n. 2020197). Il donatore, che è stato reclutato apertamente, ha fornito un consenso informato formale e ha accettato l'uso scientifico delle cellule.
NOTA: L'interfaccia corrente (il software speciale denominato "ccssHMI" in esecuzione con il sistema operativo Windows XP) è la schermata operativa fondamentale. Sotto la suddetta i.......
Mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Abbiamo utilizzato tre linee hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Abbiamo ottimizzato il protocollo di manutenzione attraverso esperimenti giornalieri eseguiti manualmente e ulteriormente ottimizzato i programmi dettagliati attraverso i sette esperimenti preliminari eseguiti dal sistema. Ad esempio, le sollecitazioni di taglio causate dalle velocità del liquido del flusso dello spiedo da diverse pipette maneggiate dall'uomo e dal sistema s.......
Un passaggio critico del protocollo è che se un utente rileva errori, fare clic sul pulsante Annulla, Interrompi o Ripristina in qualsiasi momento e ricominciare dal primo passaggio. Il software può evitare errori umani, tra cui la doppia prenotazione, l'apertura delle porte mentre le attività del sistema sono attive e la mancanza di rifornimento. Un altro punto critico per una differenziazione efficace ed efficiente nella cellula somatica desiderata è la corretta selezione delle linee di cellule staminali pluripoten.......
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Giappone.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
Automated culture system | Panasonic | ||
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
Dexamethasone | Merck | 266785 | |
Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β Tublin mouse | Promega | G712A |
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