Автоматизированная система культивирования для поддержания и дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Summary

Здесь мы представляем протокол для автоматизированной системы культивирования клеток. Эта автоматизированная система культивирования сокращает трудозатраты и приносит пользу пользователям, в том числе исследователям, незнакомым с обращением с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), от поддержания iPS-клеток до дифференцировки в различные типы клеток.

Abstract

Ожидается, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с бесконечной способностью к самораспространению найдут применение во многих областях, включая выяснение патологий редких заболеваний, разработку новых лекарств и регенеративную медицину, направленную на восстановление поврежденных органов. Несмотря на это, социальное применение ИПСК по-прежнему ограничено. Отчасти это связано с трудностью воспроизведения дифференциации в культуре, даже при наличии продвинутых знаний и сложных технических навыков, из-за высокой чувствительности ИПСК к мельчайшим изменениям окружающей среды. Решить эту проблему может применение автоматизированной системы культуры. Эксперименты с высокой воспроизводимостью, не зависящие от квалификации исследователя, можно ожидать в соответствии с общей процедурой для различных институтов. Несмотря на то, что ранее было разработано несколько автоматизированных систем культивирования, которые могут поддерживать культуры ИПСК и индуцировать дифференциацию, эти системы являются тяжелыми, большими и дорогостоящими, поскольку в них используются гуманизированные, многошарнирные роботизированные руки. Чтобы решить вышеуказанные проблемы, мы разработали новую систему, использующую простую систему направляющих по осям x-y-z, что позволило сделать ее более компактной, легкой и дешевой. Кроме того, пользователь может легко изменять параметры в новой системе для разработки новых задач по обработке. После того, как задача поставлена, все, что нужно сделать пользователю, это подготовить iPSC, заранее поставить реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения нужной задачи, выбрать номер задачи и указать время. Мы подтвердили, что система может поддерживать ИПСК в недифференцированном состоянии через несколько пассажей без фидерных клеток и дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты, гепатоциты, нейральные предшественники и кератиноциты. Система позволит проводить высоковоспроизводимые эксперименты в разных учреждениях без необходимости в квалифицированных исследователях и будет способствовать социальному внедрению ИПСК в более широкий спектр областей исследований, уменьшая препятствия для новых заявок.

Introduction

Цель данной статьи – представить реальные и подробные процедуры работы с автоматизированной системой культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), которую мы создали в сотрудничестве с компанией, и показать репрезентативные результаты.

С момента публикации статьи в 2007 году ИПСК привлекает внимание во всем мире¹. Из-за его величайшей особенности дифференцироваться в любой тип соматических клеток, ожидается, что он будет применяться в различных областях, таких как регенеративная медицина, выяснение причин трудноизлечимых заболеваний и разработка новых

Protocol

Комитет по этике Медицинского университета Кансай одобрил создание и использование здоровых ИПСК добровольного происхождения под названием KMUR001 (одобрение No 2020197). Донор, который был открыто завербован, предоставил официальное информированное согласие и согласился с научным использо.......

Discussion

Критически важным шагом в протоколе является то, что если пользователь обнаружит какие-либо неисправности, нажмите кнопку отмены, остановки или сброса в любое время и начните с первого шага. Программное обеспечение позволяет избежать человеческих ошибок, в том числе двойного брониров?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A