Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Riepilogo

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Abstract

Le cellule ciliate cocleari sono i recettori sensoriali del sistema uditivo. Queste cellule si trovano nell'organo di Corti, l'organo sensoriale responsabile dell'udito, all'interno del labirinto osseo dell'orecchio interno. Le cellule ciliate cocleari sono costituite da due tipi anatomicamente e funzionalmente distinti: cellule ciliate esterne e interne. Il danno a uno di essi provoca la perdita dell'udito. In particolare, poiché le cellule ciliate interne non possono rigenerarsi e il loro danno è permanente. Pertanto, la coltivazione in vitro di cellule ciliate primarie è indispensabile per studiare gli effetti protettivi o rigenerativi delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.

Dopo la rimozione manuale della parete laterale cocleare, l'epitelio uditivo è stato meticolosamente sezionato dal miolo cocleare al microscopio, incubato in una miscela composta da tripsina-EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C e delicatamente sospeso nel terreno di coltura utilizzando un puntale per pipette da 200 μL. La sospensione cellulare è stata fatta passare attraverso un filtro cellulare, il filtrato è stato centrifugato e le cellule sono state coltivate in piastre a 24 pozzetti. Le cellule ciliate sono state identificate in base alla loro capacità di esprimere un complesso di meccanotrasduzione, la miosina-VIIa, che è coinvolta nelle tensioni motorie, e tramite marcatura selettiva della F-actina utilizzando falloidina. Le cellule hanno raggiunto l'>90% di confluenza dopo 4 giorni in coltura. Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vitro e dimostrare l'efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.

Introduzione

Le cellule ciliate cocleari svolgono un ruolo importante nel rilevamento del suono e nella trasmissione del segnale al nervo uditivo. Le cellule ciliate sono cellule meccanicistiche che funzionano come recettori sensoriali primari e convertono le vibrazioni sonore in segnali elettrici nei vertebrati. L'epitelio sensoriale dell'orecchio interno dei mammiferi comprende una singola fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne. In diverse aree di base della membrana, le cellule ciliate percepiscono i suoni a frequenze diverse (tra 20 e 2.000 Hz)¹. La funzione delle cellule ciliate esterne è un processo di amplificazione meccanica attiva che aiuta a mettere a punto l'orecchio interno dei mammiferi, conferendo un'elevata sensibilità al suono. Le cellule ciliate interne sono responsabili del rilevamento dei suoni. Dopo la depolarizzazione graduale, le informazioni acustiche vengono trasmesse al cervello attraverso le fibre nervose uditive².

La perdita dell'udito può essere causata da difetti genetici, invecchiamento, traumi da rumore o dall'uso eccessivo di farmaci ototossici, che costituiscono un grave problema di salute in tutto il mondo ^3,4. La perdita dell'udito deriva principalmente da danni irreversibili alle cellule ciliate⁵. Per quanto riguarda la perdita dell'udito indotta dal rumore, sebbene i ricercatori abbiano raggiunto un consenso su diversi dettagli della sua eziologia, manca una comprensione completa dei numerosi meccanismi sottostanti. Le cellule ciliate esterne sono particolarmente vulnerabili alla sovraesposizione acustica⁶. Le cellule ciliate cocleari meccanosensibili sono coinvolte nella perdita dell'udito legata all'età; Tuttavia, i meccanismi molecolari e cellulari alla base della degenerazione delle cellule ciliate rimangono sconosciuti. Diversi cambiamenti nei processi molecolari portano all'invecchiamento delle cellule ciliate, allo stress ossidativo, alla risposta al danno del DNA, all'autofagia e alla disregolazione dell'espressione e della trascrizione dei geni correlati alla specializzazione delle cellule ciliate⁷.

Poiché l'orecchio interno è racchiuso nell'osso temporale, in profondità nell'osso più duro del corpo, è sperimentalmente inaccessibile, ponendo una sfida alle indagini sui meccanismi di riparazione e rigenerazione delle cellule ciliate. Quindi, la creazione di colture in vitro per studiare la funzione delle cellule ciliate è diventata un metodo ideale per la ricerca sui meccanismi di rigenerazione e lesione dell'orecchio interno. Le procedure per la preparazione di colture organotipiche cocleari sono state descritte in studi precedenti ^8,9,10. I ricercatori di tutto il mondo hanno impiegato varie tecniche di microdissezione cocleare e di preparazione della superficie. Nonostante le sfide persistenti, vari sistemi di coltura di cellule ciliate primarie sono stati stabiliti con successo in vitro. Le colture di organi cocleari contengono vari tipi di cellule, tra cui cellule ciliate, cellule di Deiters, cellule di Hensen, cellule pilastro e fibre nervose uditive. Una comprensione approfondita dei cambiamenti nelle cellule ciliate a livello cellulare e molecolare dopo una lesione consentirà lo sviluppo di strumenti di ricerca più potenti. Questo studio mirava a dimostrare i passaggi per isolare gli organi cocleari dai topi neonatali e staccare enzimaticamente le abbondanti cellule ciliate per gli studi in vitro. La natura delle cellule coltivate è stata confermata utilizzando la colorazione in immunofluorescenza.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati (n. 2021-847) dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Xi'an Jiaotong.

1. Sterilizzazione e preparazione del materiale

1. Sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando la disinfezione a vapore ad alta temperatura e ad alta pressione e asciugarli in un'incubatrice a 50 °C per una notte.
2. Preparare in anticipo 100 mL di terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 10 mg/mL di penicillina/streptomicina (aggiungere 10 mL di FBS e 10 μL di soluzione madre di penicillina a 90 mL di terreno di Dulbecco Modified Eagle Medium (EMEM)) e conservare a 4 °C.

2. Dissezione e asportazione dell'osso temporale per la raccolta degli epiteli uditivi

1. Sopprimere un numero totale di 10 topi neonati (di età compresa tra P3 e P5) mediante decapitazione su ghiaccio. Utilizzare una metodologia alternativa ed eticamente approvata, se necessario.
2. Tenere la testa in posizione, aprire il cuoio capelluto lungo la sutura sagittale utilizzando forbici microoperatorie e separare e fissare il cuoio capelluto bilateralmente con le dita, come mostrato nella Figura 1A.
3. Rimuovere il cervello utilizzando un piccolo elevatore periostale e dividere in due il cranio basale. Taglia il cranio con le forbici e capovolgilo in avanti per aprire il cranio; Usa la punta delle forbici per raschiare il cervello ed esporre la base del cranio.
4. Osservare le ossa temporali bilaterali alla base del cranio (Figura 1C). Usa le forbici per tagliare la base del cranio lungo la linea mediana, raschiare via la pelle e rimuovere l'osso non necessario (Figura 1D,D').
5. Conservare e trasferire le ossa temporali in piastre di Petri sterili da 35 mm contenenti una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).
6. Utilizzare due pinze a punta #5 per rimuovere la bolla e il tessuto circostante dalla porzione petrosa dell'osso temporale (Figura 1E).
   NOTA: In questa fase, il labirinto osseo nell'osso temporale dei topi non sarebbe completamente calcificato e sarebbe facilmente sezionato usando il forcipe.
7. Tenere la pinza con una mano per fissare la parte semicircolare dell'osso temporale e infilare il piede inferiore della pinza nella nicchia rotonda della finestra con l'altra mano per separare l'osso laterale della coclea dal vestibolo della scala. Rimuovere con cautela la porzione petrosa dell'osso temporale senza toccare l'epitelio OC. Successivamente, separare e rimuovere con cura il labirinto osseo della coclea dall'estremità basale all'estremità apicale (Figura 1F).
8. Microisolare con cura l'organo dell'epitelio sensoriale di Corti dal modiolo utilizzando una pinza a #5 punte (Figura 1G).
9. Tenere il legamento spirale, separarlo con cura dalla stria vascolare con una pinza microoperatoria e trasferire l'epitelio uditivo pulito in una piastra di coltura sterile da 3 mm contenente HBSS utilizzando una pipetta da 200 μL (Figura 1H).
10. Raccogliete 20 campioni da ciascun animale e trasferiteli rapidamente in una capsula di Petri sterile da 100 mm contenente HBSS per la fase successiva della preparazione (Figura 1).

3. Disaggregazione enzimatica per l'ottenimento di cellule ciliate uditive

1. Trasferire l'epitelio uditivo in 10 mL di DMEM fresco contenente lo 0,25% di tripsina e incubare a 37 °C per 12 min.
2. Utilizzando un puntale per pipette da 200 μL, separare delicatamente le cellule ciliate dalla lamina basale e dalle altre cellule al microscopio operatorio.
3. Aggiungere altri 10 mL di terreno di coltura per inibire la disaggregazione.
4. Filtrare le cellule sospese nel terreno di coltura attraverso un filtro da 70 μm, raccogliere il filtrato in una provetta pulita da 50 ml e centrifugarlo a 300 × g per 5 minuti.
5. Risospendere le cellule ciliate in almeno 5 mL di terreno di coltura pipettandole delicatamente su e giù utilizzando un puntale per pipette da 1.000 μL. Evitare di introdurre bolle.
6. Posizionare in anticipo un vetrino coprioggetti sul fondo di una piastra a sei pozzetti. Contare le cellule e coltivarle a una densità di 10,⁶ cellule/mL in piastre a sei pozzetti.
7. Far crescere le cellule aderenti in 2 mL di DMEM (contenente il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) a 37 °C e il 5% di CO₂ . Cambiare il terreno di coltura ogni giorno.
   NOTA: Va detto che l'utilizzo di questo protocollo non comporta l'ottenimento di cellule ciliate pure. Sulla base di questo metodo di coltura cellulare primaria, si consiglia di utilizzare cellule d2 o d3 per ulteriori studi, poiché le cellule ciliate potrebbero costituire circa il 70% delle cellule in coltura ed essere in buono stato.

4. Colorazione immunofluorescente

1. Prelevare le cellule coltivate da d1 a d6 (un pozzetto al giorno). Aspirare il terreno di coltura e sciacquare le cellule 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere il fissativo e sciacquare le cellule per 3 x 3 minuti con PBS.
4. Permeabilizzare le cellule con PBS contenente lo 0,2% di Triton X-100 per 10 minuti a RT.
5. Incubare le cellule permeabilizzate con una soluzione bloccante costituita da FBS al 10% in PBS per 20 minuti a RT.
6. Colorare le cellule con anticorpo monoclonale anti-miosina (diluito a 1:200 in PBS) a 4 °C durante la notte.
7. Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile e incubarle con anticorpo secondario (Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit MYO7A, diluito 1:500 in PBS) e falloidina marcata con fluoresceina (Alexa Fluor 488, per identificare la struttura cellulare) per 2 ore a RT.
8. Sciacquare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi secondari.
9. Aggiungere 1-2 gocce di mezzo di montaggio con DAPI sui vetrini, montare i vetrini coprioggetti e posizionarli sotto un microscopio confocale a scansione laser per catturare foto delle cellule.

5. Analisi statistica

1. Eseguire l'analisi della varianza a due vie (ANOVA) seguita dai test post hoc di Tukey per analizzare le variazioni dei valori di grigio della miosina-VIIa e della falloidina nel tempo. Utilizzare il metodo di marcatura delle lettere per contrassegnare le differenze statistiche.
2. Eseguire ulteriori ANOVA unidirezionali seguite dai test post-hoc di Tukey per confrontare il rapporto cellulare falloidina-positivo tra i campioni cellulari dal giorno 1 al giorno 6 e il rapporto cellulare miosina-VII-positivo negli stessi giorni.

Risultati

Seguendo questo protocollo, abbiamo seminato le cellule isolate. I semi primari di cellule ciliate cocleari sono stati considerati efficaci se le cellule non galleggiavano nel terreno di coltura e non si diffondevano entro 24 ore. Abbiamo determinato il numero di cellule ciliate dopo che hanno aderito e si sono diffuse in aggregati piatti sul fondo del piatto. Dopo 1 giorno, le cellule ciliate vive sono state strettamente aderenti al fondo della piastra di coltura e le cellule non aderenti sono state rimosse mediante ris...

Discussione

Rispetto alla linea cellulare HEI-OC1, le colture primarie di cellule ciliate hanno replicato in modo più accurato lo stato fisiologico delle cellule in vivo. Pertanto, il metodo di coltura primaria uditiva stabilito isolando cellule viventi dagli organi cocleari e coltivandole immediatamente sembra essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita sui sistemi uditivi. Alcune tecniche sono fondamentali per una cultura di successo. In primo luogo, ridurre al minimo la durata della separazione dell'organo di Cort...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture