Выделение и культивирование первичных волосковых клеток улитки у новорожденных мышей

Summary

В данной статье мы представляем подробный протокол выделения и культивирования первичных волосковых клеток улитки у мышей. Первоначально орган корти препарировали из неонатальных (в возрасте 3-5 дней) мышиных улиток под микроскопом. Впоследствии клетки ферментативно переваривали в одноклеточную суспензию и идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции через несколько дней в культуре.

Abstract

Волосковые клетки улитки являются сенсорными рецепторами слуховой системы. Эти клетки расположены в кортиевом органе, органе чувств, отвечающем за слух, в костном лабиринте внутреннего уха. Кохлеарные волосковые клетки состоят из двух анатомически и функционально различных типов: наружных и внутренних волосковых клеток. Повреждение любого из них приводит к потере слуха. Примечательно, что внутренние волосковые клетки не могут регенерировать, и их повреждение является необратимым. Следовательно, культивирование первичных волосковых клеток in vitro необходимо для изучения защитных или регенеративных эффектов волосковых клеток улитки. Это исследование было направлено на поиск метода выделения и культивирования волосковых клеток мышей.

После ручного удаления боковой стенки улитки слуховой эпителий тщательно отделяли от кохлеарного модиолы под микроскопом, инкубировали в смеси, состоящей из 0,25% трипсина-ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °С и осторожно суспендировали в питательной среде с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр, фильтрат центрифугировали, а клетки культивировали в 24-луночных планшетах. Волосковые клетки были идентифицированы на основе их способности экспрессировать механотрансдукционный комплекс, миозин-VIIa, который участвует в двигательном напряжении, а также путем селективного мечения F-актина с помощью фаллоидина. Клетки достигали >90% слияния через 4 дня в культуре. Этот метод может улучшить наше понимание биологических характеристик культивируемых волосковых клеток in vitro и продемонстрировать эффективность культур кохлеарных волосковых клеток, создавая прочную методологическую основу для дальнейших слуховых исследований.

Introduction

Волосковые клетки улитки играют важную роль в обнаружении звука и передаче сигнала к слуховому нерву. Волосковые клетки — это механистические клетки, которые функционируют как первичные сенсорные рецепторы и преобразуют звуковые колебания в электрические сигналы у позвоночных. Сенсорный эпителий внутреннего уха млекопитающих состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов наружных волосковых клеток. В разных основных участках мембраны волосковые клетки воспринимают звуки на разных частотах (от 20 до 2000 Гц)¹. Функция наружных волосковых клеток заключается в активном механическом процессе усиления, который помогает тонко настро....

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены (No 2021-847) Комитетом по использованию животных и уходу за животными Сианьского университета Цзяотун.

1. Стерилизация и подготовка материала

1. Стерилизуйте инструменты для препарирования с помощью паровой дезинфекци?.......

Discussion

По сравнению с клеточной линией HEI-OC1 первичные культуры волосковых клеток более точно воспроизводили физиологическое состояние клеток in vivo. Таким образом, метод первичного культивирования слуховых клеток, основанный на выделении живых клеток из органов улитки и их немедленном культи.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm BioLite cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	130182	using for culture
35 mm Nunc cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	150318	using for culture
6-well palate	Thermo Fisher Scientific	310109005	using for culture
70 µm cell strainers	BD Company	352350	using for filter
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	immunofluorescent staining
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientifc	A11008	immunofluorescent staining
day 3-5 neonatal murine			provided by Xi'an Jiaotong University
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	using for culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483020	using for culture
Forceps	Dumont	5#	using for dissection
Leica anatomy microscope	Germany	S9i	using for dissection
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122	using for culture
Rabbit plyclonal to Myosin VIIa	Abcam company	ab92996	immunofluorescent staining
Scissor	Belevor	10cm/04.0524.10	using for dissection
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	immunofluorescent staining
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200072	using for culture