שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

Summary

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.

Abstract

ייצור צמחים מרוכבים עם שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים באמצעות טרנספורמציית שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום הוא כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. טרנספורמציית שורשים שעירים מתבססת במגוון רחב של דיקוטילדונים ובמספר מיני מונוקוטילדונים והיא כמעט בלתי תלויה בגנוטיפ. השיטה המסורתית של הזרקת היפוקוטיל עם קנה שורש A . להשגת צמחים מרוכבים אינה יעילה, גוזלת זמן, מייגעת, ולעתים קרובות גורמת למוות של צמחי היפוקוטיל רכים וזעירים. בעבר הוקמה טרנספורמציה יעילה ביותר, חד-שלבית, של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes , אשר מבטלת את הצורך בהשתלה לאחר ייצור שורשים שעירים. במחקר זה הוסרו היפוקוטיל חלקי ושורש ראשוני, אתר חתך ההיפוקוטיל היה מצופה בקנה-שורש A, ולאחר מכן נשתלו היפוקוטיל בוורמיקוליט סטרילי. לאחר 12 ימי טיפוח, חתך ההיפוקוטיל התרחב והושרו שורשים שעירים חדשים. מאמר זה מספק את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך A. rhizogenes, כאשר יעילותה הודגמה על ידי ייצור צמחים מרוכבים של סויה בר, Solanum americanum ודלעת.

Introduction

Agrobacterium rhizogenes הוא חיידק קרקע גראם-שלילי ממשפחת Rhizobiaceae. A. rhizogenes יכול להדביק כמעט את כל dicotyledons, כמה monocotyledons, ואת gymnosperms בודדים דרך פצעים, לייצר שורשים שעירים בצמחים נגועים. החיידק נושא את פלסמיד Ri (השראת שורש), וה-T-DNA של פלסמיד Ri נושא את הגן הסינתזה opine ואת הגנים rol (גנים לוקוס שורש). לאחר שה-T-DNA של פלסמיד Ri נכנס לתא צמח ומשולב בכרומוזום מארח, ביטוי הגנים של הרול גורם לייצור שורשים שעירים¹. וקטור ביטוי בינארי של צמח הנושא גן מטרה הופך לקנה שורש A, וקנה השורש A. שעבר טרנספורמציה משמש להדבקת צמח. שורשים טרנסגניים יכולים להיות מושרים בצ....

Protocol

1. תנאי גידול צמחים ותרבית A. rhizogenes

1. זריעת זרעים
   הערה: זרעי סויה פראיים נאספו במחוז יאנגו, ליאוצ'נג, סין; זרעים של S. americanum ודלעת זן מקומי Yinsu נרכשו מהשוק.
   1. לאסוף זרעים של סויה בר, S. americanum, ואת הזן המקומי של דלעת, לזרוע אותם vermiculite בעומק של 1 ס"מ, ולהשקות אותם היטב. ל.......

Discussion

שיטת השורש השעיר בתיווך קנה שורש A. היא שיטה פשוטה ויעילה יותר לייצור צמחים מרוכבים מאשר שיטת הזרקת היפוקוטיל. שיטת ARM החד-שלבית משפרת משמעותית את יעילות טרנספורמציית השורשים השעירים, מקצרת את זמן ייצור השורשים השעירים, מגדילה את מספר השורשים השעירים ומפחיתה את כמות העבודה הכרוכה בכך........

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
kanamycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A506636
LB medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113
plastic box	LiaoSu		8 cm x 11 cm x 9 cm
pumpkin			local variety Yinsu
streptomycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610494
Tanon-5200Multi machine	Tanon Co., Ltd., China	5200Multi	chemiluminescence imaging system
tomato			local variety Zhongshu4
wild soybean			collected in Yanggu County, Liaocheng, China