Этот метод обеспечивает доступный и гибкий протокол подготовки сеток электронной микроскопии (ЭМ) для клеточной криотомографии in situ и коррелятивной световой и электронной микроскопии (КЛЭМ).
Клеточная криотомография in situ является мощным методом для изучения сложных объектов в их естественном замороженно-гидратированном клеточном контексте, что делает ее очень актуальной для клеточной биологии и вирусологии. Потенциал сочетания криотомографии с другими методами микроскопии делает ее идеальным методом для интегративной и коррелятивной визуализации. Тем не менее, подготовка образцов для клеточной томографии in situ не является простой задачей, поскольку клетки не прикрепляются и не растягиваются по сетке электронной микроскопии. Кроме того, сетки сами по себе хрупкие и могут сломаться при слишком сильном обращении, что приведет к потере видимых областей. Геометрия чашек для культур тканей также может представлять проблему при манипулировании сетками с помощью пинцета. В этой статье мы опишем советы и рекомендации по преодолению этих (и других) проблем и подготовке высококачественных образцов для клеточной криотомографии in situ и корреляционной визуализации адгезивных клеток млекопитающих. Благодаря постоянному прогрессу в технологии криомикроскопии, этот метод имеет огромные перспективы для углубления нашего понимания сложных биологических систем.
Клеточная криотомография in situ является мощным методом, позволяющим изучать биологически значимые структуры в клетках без химической фиксации. При присоединении клеток к электромагнитным сеткам и замораживании решеток в криогене интересующие объекты замораживаются в их естественном клеточном контексте без образования кристаллического льда из внутриклеточной воды 1,2. Как химическая фиксация, так и образование кристаллического льда могут нарушать структуры соответствующих молекул, таких как белки и липиды, снижая биологическую точность изображений, полученных с помощью этих методов 3,4. В томографии сетки получают изображения под пошаговыми углами с помощью электронной микроскопии, и эти изображения затем используются для построения трехмерных представлений целевой области, изображенной5. Криотомография in situ может использоваться наряду с другими методами микроскопии для интегративной и коррелятивной визуализации, такими как криофлюоресцентная визуализация, мягкая рентгеновская томография и криоFIB/SEM (криогенная сфокусированная ионная пучок/сканирующая электронная микроскопия)6,7,8,9,10,11 . Интеграция нескольких методов позволяет получить больше информации о структуре или процессе, чем любой отдельный метод микроскопии.
Несмотря на все преимущества клеточной криотомографии in situ, подготовка образцов может оказаться сложной задачей по целому ряду причин. Из-за их хрупкости силовые манипуляции с электронными микроскопическими сетками могут привести к их повреждению, при этом тонкий углеродный слой, в частности, хрупкий и склонный к разрыву, что уменьшает видимую площадь сеток. Сетками для электронной микроскопии также трудно манипулировать из-за их небольшого размера, и они склонны отделяться от поверхности лунок или микрослайдов, используемых для выращивания клеток. Манипуляции с решетками внутри лунок или микропредметными стеклами могут оказаться сложными из-за их геометрии. Неправильная подготовка сеток (например, возможность их плавания) может привести к низкой плотности ячеек и уменьшению количества потенциальных областей визуализации, особенно когда клетки не склонны прикрепляться к самим сеткам. При прямой клеточной криотомографии клетки должны распространяться очень тонким слоем, что может быть нарушено по многим причинам, включая неправильную температуру или грубое обращение с решетками.
Методы, представленные в этой статье, призваны справиться с этими наиболее распространенными ошибками, возникающими при подготовке сеток электронной микроскопии для криотомографии. Использование пинцета с углом 5/15 позволяет манипулировать сетками в луночных планшетах или микропредметных стеклах. Раствор фибронектина, нанесенный на обе стороны сеток перед нанесением покрытия, снижает вероятность появления плавающих сеток, что полезно для обеспечения того, чтобы сетки имели достаточную плотность клеток и что решетки с меньшей вероятностью будут повреждены из-за манипуляций. Сохраняя решетки в инкубационном состоянии при температуре 37°C непосредственно перед замораживанием, мы также гарантируем, что клетки хранятся в комфортных условиях, чтобы предотвратить втягивание тонких краев клеток. Промокание сеток с тыльной стороны также предотвращает повреждение клеток механическим воздействием. В совокупности эти меры повышают успешность подготовки образцов для исследований клеточной криотомографии in situ , повышая доступность этого подхода к визуализации.
1. Подготовка сетки
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальном проекте запланируйте максимум 8-12 решеток на сеанс погружного замораживания и 4-5 решеток на скважину. Более того, это приведет к очень длительному сеансу замораживания, что может вызвать повышенный стресс клеток, загрязнение льдом и ошибки пользователя.
2. Посевные решетки
3. Трансфекция
4. Погружная заморозка
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните клетки при температуре 37 °C до тех пор, пока они не понадобятся для промокания. Кроме того, обязательно обратите внимание на углеродную сторону решеток на протяжении всего процесса.
После котрансфекции HIViGFPΔEnv и psPAX2 все решетки имели минимальный разрыв углеродного слоя. Сетки визуализировали с помощью фазовой световой микроскопии и флуоресцентной световой микроскопии через 24 ч после инкубации с трансфекционным реагентом (рис. 2). Ячейки как на фиктивных сетках, так и на котрансфицированных сетках содержали жизнеспособные ячейки в нескольких квадратах сетки.
psPAX2 кодирует все структурные и ферментативные белки ВИЧ-1 без флуоресцентного мечения. HIViGFPΔEnv похож на psPAX2, но имеет коды для GFP-меченого белка ВИЧ Gag. Обе плазмиды являются ΔEnvelope. Котрансфекция приводит к нативной сборке и почкованию флуоресцентных частиц ВИЧ-1, что делает эту систему отличной для CLEM-исследований ВИЧ в условиях 1-го уровня биобезопасности. Котрансфицированные сетки показали подмножество клеток, демонстрирующих зеленую флуоресценцию, что указывает на успешную котрансфекцию. Ни одна клетка на макетной сетке не продемонстрировала флуоресценции, что еще раз подтвердило котрансфекцию с использованием HIViGFPΔEnv и psPAX2. После просмотра сеток с помощью световой микроскопии решетки были погружены в замороженную и перемещены на длительное хранение в жидком азоте.
На рисунке 3 показаны результаты, полученные с помощью сеток, полученных с использованием того же экспериментального метода, но с использованием несколько отличающихся плазмидных конструкций. U2OS-содержащие сетки совместно трансфицировали с использованием различных клонов ВИЧ (HIVmCherryΔEnv и NL4-3ΔEnvGFP в соотношении 1:6). Поскольку использовалась более высокая масса флуоресцентно меченных плазмид, эти сетки позволили наблюдать большее количество трансфицированных клеток, обеспечивая преимущество при получении изображений с помощью cryoCLEM и cryoET. С помощью cryoCLEM для каждой сетки с помощью криофлюоресцентной микроскопии были созданы полные сетчатые атласы для записи местоположения всех котрансфицированных клеток. Когда расположение клеток было известно, была проведена криоЭТ. Был собран полный атлас сетки с малым увеличением и наложен на флуоресцентный атлас, собранный при криофлюоресценции (рис. 3A). Криотомограммы были собраны на клеточных участках, фиксирующих сложные детали жизненного цикла вируса, включая сборку и почкование ВИЧ из клеток (рис. 3B).
Рисунок 1: Рабочий процесс заполнения ячеек на сетках. Схема, изображающая общую процедуру засеивания клеток на криоЭМ-решетки. Процесс разделен на четыре основных этапа, включая (A) подготовку сеток в лунках для посева, (B) добавление соответствующего количества клеток в каждую лунку, (C) дополнительную трансфекцию клеток для флуоресцентной визуализации и (D) замораживание сеток для витрификации образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Котрансфекция U2OS с использованием HIViGFPΔEnv и psPAX2. Клетки U2OS совместно трансфицировали с GFP-содержащими HIViGFPΔEnv и psPAX2 в соотношении 1:3. Сетки визуализировали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии. Клетки, которые имеют экспрессию GFP, указывают на успешную котрансфекцию. Масштабная линейка: 500 мкм. Масштабная линейка (вставки): 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Потенциальные последующие криометоды . (A) Изображение cryoCLEM с котрансфицированными клетками U2OS. Клетки, выделенные зеленым цветом, представляют собой ВИЧ-продуцирующие клетки и используются для измерения успешности котрансфекции. Красные пункты обозначают mCherry с меткой ВИЧ-1 Gag. Масштабная линейка: 250 мкм. Масштабная линейка (вставка): 25 мкм (B) КриоЭТ-изображение нескольких частиц ВИЧ, отпочковывающихся от плазматической мембраны клеток U2OS. Масштабная линейка: 50 нм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь мы предоставили доступный, гибкий и воспроизводимый протокол для посева клеток на сетках электронной микроскопии для криоэлектронной томографии in situ . Этот метод может быть легко адаптирован к потребностям последующих применений и/или экспериментальным требованиям. В дополнение к большой гибкости мы описали рабочий процесс, который оптимизирует и уменьшает распространенные ошибки при засеивании сетки, в частности, обширное повреждение углеродного слоя, низкую плотность ячеек и плохую структурную целостность выступов тонких ячеек.
Несмотря на то, что описанный здесь протокол предоставляет несколько альтернатив, есть несколько важных шагов, которые необходимо выполнить для оптимизации общих результатов. Одной из самых больших проблем при засеве ячейками сетки является отделение и всплытие решеток из лунки или микрослайда. Поэтому важно полностью смочить сетку адгезивным раствором с обеих сторон и не допустить ее высыхания в течение инкубационного периода. При использовании напечатанных на 3D-принтере держателей сеток имейте в виду, что многократная смена носителя в этих держателях может привести к образованию плавающих сеток, поскольку воздух, попавший под решетку, может вытолкнуть ее из держателя.
Наш выбор пинцета также улучшает качество сетки, обеспечивая геометрически выгодный способ манипулирования сетками без значительного изгиба сетки, который может повредить углеродный слой. Поддержание клеток при температуре 37 °C в течение как можно более длительного времени перед погружением уменьшает страдания клеток и увеличивает количество тонких визуальных клеток на сетке. Наконец, промокание с золотой стороны защитит клетки от агрессивных механических сил, которые могут привести к повреждению хрупких клеточных структур.
Несмотря на то, что сетка не включена в этот протокол, было показано, что фотомикроструктурирование сетки увеличивает количество визуализируемых ячеек за счет оптимизации их прикрепления к центру квадратов сетки14. Наконец, напечатанные на 3D-принтере держатели сетки недавно стали использоваться для уменьшения повреждения сетки за счет ограничения прямых манипуляций с сеткой12.
Важно отметить, что этот протокол оптимизирован для визуализации тонких краев и выступов клеток для применения криотомографии. Мы предлагаем устранить различные условия из наших рекомендаций в протоколе, чтобы найти наилучший результат для выбранных последующих приложений. В целом, этот протокол обеспечивает надежный, но универсальный метод засева ячеек на сетках, который можно настроить под конкретные нужды.
Благодарим лабораторию «Манский» за доступ к оборудованию для погружной заморозки. Часть этой работы была проведена в центре определения характеристик Университета Миннесоты, который получает частичную поддержку от Национального научного фонда (NSF) через Научно-инженерный центр исследования материалов (MRSEC; Номер гранта DMR-2011401) и Национальная инициатива по учебным программам в области неврологии (NNCI; Номер гранта ECCS-2025124). Мы хотели бы поблагодарить за финансирование Центр «Поведение ВИЧ в вирусной среде» (B-HIVE; 1U54AI170855-01) и Центр структурной биологии ВИЧ Дьюка (DCHSB; U54AI170752) центр.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved