Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Summary

Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het produceren van nierorganoïden uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van suspensiekweekomstandigheden. De primaire nadruk van deze studie ligt op de bepaling van de initiële celdichtheid en de WNT-agonistconcentratie, wat ten goede komt aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nierorganoïde-onderzoek.

Abstract

Nierorganoïden kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Deze organoïden zijn veelbelovend voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en mogelijke therapeutische toepassingen. Dit artikel presenteert een stapsgewijze procedure om nierorganoïden te maken van iPSC's, beginnend bij de posterieure primitieve streep (PS) tot het intermediaire mesoderm (IM). De aanpak is gebaseerd op het APEL 2-medium, een gedefinieerd, dierlijk componentvrij medium. Het wordt aangevuld met een hoge concentratie WNT-agonist (CHIR99021) gedurende een duur van 4 dagen, gevolgd door fibroblastgroeifactor 9 (FGF9)/heparine en een lage concentratie CHIR99021 gedurende nog eens 3 dagen. Tijdens dit proces wordt de nadruk gelegd op het selecteren van de optimale celdichtheid en CHIR99021 concentratie aan het begin van iPSC's, aangezien deze factoren van cruciaal belang zijn voor een succesvolle generatie van nierorganoïden. Een belangrijk aspect van dit protocol is de suspensiecultuur in een laag klevende plaat, waardoor de IM zich geleidelijk kan ontwikkelen tot nefronstructuren, die glomeraire, proximale buisvormige en distale buisvormige structuren omvatten, allemaal gepresenteerd in een visueel begrijpelijk formaat. Over het algemeen biedt dit gedetailleerde protocol een efficiënte en specifieke techniek om nierorganoïden te produceren uit verschillende iPSC's, wat zorgt voor succesvolle en consistente resultaten.

Introduction

De nier speelt een cruciale rol bij het handhaven van fysiologische homeostase, afhankelijk van de functionele eenheid. Nefronen, die afvalstoffen uitscheiden, kunnen de samenstelling van lichaamsvloeistoffen reguleren. Chronische nierziekte (CKD), veroorzaakt door erfelijke mutaties of andere risicofactoren, zal uiteindelijk evolueren naar nierziekte in het eindstadium (ESKD)^1,2. ESKD is blijkbaar te wijten aan de beperkte regeneratiecapaciteit van nefronen. Nierfunctievervangende therapie is dus vereist. Gerichte differentiatie van humane iPSC's maakt het mogelijk om in vitro patiëntspecifieke 3D-ni....

Protocol

De iPSC's die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron. De cellen werden onderhouden met mTeSR-medium op in de handel verkrijgbare platen met een matrix gecoate platen van het basaalmembraan (zie Tabel met materialen). Tabel 1 bevat alle mediumsamenstellingen die in het onderzoek zijn gebruikt.

1. Plateren van iPSC's voor differentiatie en het induceren van posterieure primitieve strepen (PS)

1. Was iPSC's op de membraanmatrix-gecoate plaat met 6 putjes met 2 ml DPBS. Zuig het DPBS op met behulp van een pipet.
2. Voeg 1 ml van de in de handel v....

Discussion

Er is een gedetailleerd protocol beschreven voor het genereren van nierorganoïden uit iPSC's, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in het basale medium, de initiële celdichtheid en de concentratie van CHIR99021. In verschillende experimenten bleken de kritische factoren voor het succesvol genereren van nierorganoïden de initiële differentiatie van het intermediaire mesoderm (IM) en de celtoestand op dag 7 te zijn. Bovendien vertoonden verschillende iPSC-lijnen variaties in celproliferatie en differentiatiepo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304