Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.

Abstract

אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.

Introduction

לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות

Protocol

ה-iPSCs ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי. התאים נשמרו עם תווך mTeSR על לוחות ממברנות מרתף מצופים מטריצה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 1 מכילה את כל ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.

1. ציפוי iPSCs להתמיינות והשראת פס פרימיטיבי אחורי (PS)

  1. שטפ.......

Representative Results

הפקת IM מושגת על ידי הפעלת איתות WNT קנוני באמצעות מעכב GSK3 CHIR99021, ואחריו FGF9/הפרין. מיום 0 עד יום 4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחבים במהירות ומקבלים צורות רומבואידיות או משולשות. המפגש מגיע ל-90%-100% ומצטבר באופן שווה עד היום השביעי. בתרבית ההשעיה, הצברים יוצרים באופן ספונטני מבני נפרון לאחר ה?.......

Discussion

פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על .......

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לכל חברי מאו והו לאב, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו), והקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'יאנגסו (מענקים מס'. BK20210150 לגאנג וואנג).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-BottomNESTCat #701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #o7920
Antibodies
Benzyl alcoholSigma-AldrichCat #100-51-6
Benzyl benzoateSigma-AldrichCat #120-51-4
Biological Safety CabinetHaierCat #HR40 figure-materials-705 A2
Biotin anti-human LTL (1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)N/AN/A
Carbon dioxide level shakerHAMANYCat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)STEMCELL TechnologiesCat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture PlateCorningCat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCorningCat #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
DAPI stain SolutionCoolaberCat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647Thermo SCIENTIFICCat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-freeServicebioCat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)AbcamCat #ab150179
Donkey serum stosteMeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)Solarbio Life ScienceCat #D1040
Dry Bath IncubatorShanghai JingxinCat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorThermo SCIENTIFICCat #370
Geltre LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
Glass Bottom Culture DishesNESTCat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)STEMCELL TechnologiesCat #07980
Human Recombinant FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
Inverted MicroscopeOLYMPUSCat #CKX53
Laser Scanning Confocal MicroscopeOLYMPUSCat #FV3000
Methyl celluloseSigma-AldrichCat #M7027
Micro CentrifugeHENGNUOCat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)BD BiosciencesCat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)BD BiosciencesCat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo SCIENTIFICCat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)Sigma-AldrichCat #81381
mTeSR1 5X SupplementSTEMCELL TechnologiesCat #85852
mTeSR1 Basal MediumSTEMCELL TechnologiesCat #85851
Nunc CryoTube VialsThermo SCIENTIFICCat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)Cell Signaling TechnologyCat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)AbcamCat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)AbcamCat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)AbcamCat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)YEASENCat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)R&D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL TechnologiesCat #72304

References

Explore More Articles

IPSCsAPEL 2WNTCHIR990219FGF9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved