יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.

Abstract

אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.

Introduction

לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)^1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות

Protocol

ה-iPSCs ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי. התאים נשמרו עם תווך mTeSR על לוחות ממברנות מרתף מצופים מטריצה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 1 מכילה את כל ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.

1. ציפוי iPSCs להתמיינות והשראת פס פרימיטיבי אחורי (PS)

1. שטפ.......

Discussion

פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304