אנו אסירי תודה לכל חברי מאו והו לאב, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו), והקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'יאנגסו (מענקים מס'. BK20210150 לגאנג וואנג).

ה-iPSCs ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי. התאים נשמרו עם תווך mTeSR על לוחות ממברנות מרתף מצופים מטריצה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 1 מכילה את כל ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.
1. ציפוי iPSCs להתמיינות והשראת פס פרימיטיבי אחורי (PS)
<ol><li>שטפ...

שימוש בתרחיף תאי גזע פלוריפוטנטי מושרה לייצור אורגנואידים בכליות

<ol>
	<li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids:+a+pioneering+model+for+kidney+diseases.">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li><li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li><li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Mugford, J. W., Sipil&#228;, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney.">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li><li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+organogenesis+of+the+kidney.">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li><li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development.">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li><li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia.">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li><li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells.">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361 (2019).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li></ol>

פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על ...

לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות 3,4.
במהלך ההתפתחות העוברית, הכליות מקורן במזודרם הביניים (IM), המבדיל מהפס הפרימיטיבי (PS). מסלול האיתות הקלאסי של WNT עשוי לגרום לבידול נוסף של IM עם השתתפות מתואמת של FGF (FGF9, FGF20) ו- BMP (איתות Bmp7 באמצעות JNK)5,6,7. הם מייצרים שתי אוכלוסיות תאים חשובות של תאי אב נפריים (NPC): ניצן השופכה (UB), והמזנכימה המטנפרית (MM), ויוצרים את צינורות האיסוף ואת הנפרון, בהתאמה 8,9. כל נפרון מורכב מקטעים גלומרולריים וצינוריים, כגון הצינוריות הפרוקסימליות והדיסטליות, והלולאה של הנלה10,11. על פי התיאוריה שהוזכרה לעיל, הפרוטוקולים המפורסמים כיום מחקים את מפל האותות ואת גירוי גורם הגדילה כדי לגרום לאורגנואידים בכליות 5,12.
במהלך השנים האחרונות, פרוטוקולים רבים פותחו כדי להבדיל iPSCs אנושיים לתוך אורגנואידים בכליות 5,6,7,12. Takasato et al.7 ייעל את משך הטיפול ב- CHIR (אגוניסט WNT) לפני החלפתו ב- FGF9. על פי הפרוטוקול שלהם, חשיפה ל- CHIR במשך 4 ימים, ואחריה FGF9 למשך 3 ימים, היא הדרך היעילה ביותר לגרום ל- IM מ- iPSCs. מסנני Transwell שימשו כפורמט התרבות בהליך שלהם; עם זאת, שיטה זו קשה למתחילים. לכן, קומאר ואחרים ניסו לשנות את פורמט התרבות ובחרו להשעות את התרבות. הם ניתקו את התאים הדבקים ביום השביעי לזריעה בלוחות דבקים נמוכים כדי לעזור להם להתאסף לגוף עוברי (EBs) המכילים מבנים דמויי נפרון. עם זאת, אפקט האצווה של שיטות אלה היה ברור, במיוחד iPSCs שונים. בנוסף, ספרות שונה דיווחה כי ריכוז CHIR נע בין 7 מיקרומטר ל 12 מיקרומטר 5,13,14.
שיערנו כי ריכוז צפיפות התאים וה-CHIR עשויים להשפיע על ייצור אורגנואידים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שונים, וזה אומת פעמים רבות בניסויים שלנו. הפרוטוקול הנוכחי שינה מעט את שיטת המחקר של Kumar et al.13 וסיפק למשתמשים הליך שלב אחר שלב. לוח הזמנים והסכמה של הגישה מוצגים באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #701003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #o7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #100-51-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #120-51-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>Cat #HR40&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160;A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-human LTL (1:300)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Cat #B-1325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide level shaker</td>
			<td>HAMANY</td>
			<td>Cat #C0-06UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, peptides, and recombinant proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (Wnt pathway activator)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain Solution</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat #SL7102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #D22914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 HEPES-free</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>Cat #G4610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Sheep IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab150179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum stoste</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>Cat #MB4516-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>Cat #D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Shanghai Jingxin</td>
			<td>Cat #JX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltre LDEV-Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human CUBN (1:300)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat #sc-20607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution (Cell culture supplement)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant FGF-9</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #78161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>HENGNUO</td>
			<td>Cat #2-4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD31 (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #555444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human ECAD (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #610182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab30394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #39795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 5X Supplement</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTube Vials</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human GATA3 (1:300)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat #5852S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human LRP2 (1:300)</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>Cat #NBP2-39033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab224491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human WT1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab32570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>Cat #20901ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 (1:300)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat #AF4269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff APEL 2 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #05275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Cy3 (1:400)</td>
			<td>Gene Tex</td>
			<td>Cat #GTX85902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating kidney organoids in suspension from induced pluripotent stem cells

אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.

The kidney plays a critical role in maintaining physiological homeostasis, depending on its functional unit. Nephrons, which excrete waste products, can regulate the composition of body fluids. Chronic kidney disease (CKD), caused by hereditary mutations or other high-risk factors, will eventually progress to end-stage kidney disease (ESKD)1,2. ESKD is apparently due to the limited regeneration capacity of nephrons. Thus, renal replacement therapy is required. Directed differentiation of human iPSCs enables the in vitro generation of patient-specific 3D kidney organoids, which can be used to study kidney development, model patient-specific diseases, and perform nephrotoxic drug screening3,4.
During embryonic development, kidneys originate from the intermediate mesoderm (IM), which differentiates from the primitive streak (PS). The classical WNT signaling pathway may induce additional differentiation of IM with the coordinated participation of FGF (FGF9, FGF20) and BMP (Bmp7 signaling through JNK)5,6,7. They produce two important cell populations of nephric progenitor cells (NPC): the ureteral bud (UB), and the metanephric mesenchyme (MM), forming the collecting ducts and the nephron, respectively8,9. Each nephron consists of glomerular and tubular segments, such as the proximal and distal tubules, and the loop of Henle10,11. According to the theory mentioned above, currently published protocols mimic the signal cascades and growth factor stimulation to induce kidney organoids5,12.
Over the past several years, many protocols have been developed to differentiate human iPSCs into kidney organoids5,6,7,12. Takasato et al.7 optimized the duration of CHIR (WNT agonist) treatment before replacement by FGF9. According to their protocol, CHIR exposure for 4 days, followed by FGF9 for 3 days, is the most effective way to induce IM from iPSCs. Transwell filters were utilized as the culture format in their procedure; however, this method is difficult for beginners. Therefore, Kumar et al.13 tried to change the culture format and chose to suspend the culture. They dissociated the adherent cells on Day 7 for seeding in low adherent plates to help them assemble into embryoid bodies (EBs) that contain nephron-like structures. However, the batch effect of these methods was apparent, especially in different iPSCs. Additionally, different literature reported that the concentration of CHIR varied from 7 &#181;M to 12 &#181;M5,13,14.
We speculated that the concentration of cell density and the CHIR might affect the generation of organoids in different iPSCs, and this has been verified numerous times in our experiments. The present protocol has slightly modified the study method of Kumar et al.13 and provided users with a step-by-step procedure. The schedule and schematic of the approach are shown in Figure 1.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של התמיינות iPSC לייצור יעיל ליצירת אורגנואידים בכליות 

יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

Our research presents a comprehensive and efficient method for producing kidney organoids from induced pluripotent stem cells, using suspension cultural conditions. We emphasize the importance of initial cell density and WNT agonist concentration during the inducing phase, which will educate new organoid researchers. Currently, it is difficult to obtain a single high-density cell line for iPSCs.The batch impact was noticeable, particularly in various iPSC lines. Each batch's kidney organoids, may have a varied form and size. Several attempts are necessary to get the best initial cell density and concentration of CHIR for one iPSC line.We have established that the initial differentiation of the intermediary method is important for successful kidney organoid formation. Our protocol describes in detail, how to choose the optimal cell densities and CHIR concentrations during the process because different iPSC lines showed variances in cell proliferation and differentiation ability. Researchers can quickly generate the specific kidney organoids from their iPSCs.According to our protocol, by adjusting the cell density and the concentration of CHIR, it's undoubtedly beneficial for all our researchers to focus on their kidney disease. Our lab future research has to optimize the method of the protocol in disease models, regenerate new medicine and the drug screening. In recent five years, our lab will focus on the epigenetics and the cell topic drug development of various hereditary kidney disease, based on patient development, iPSC and the kidney organized disease models.

הפקת IM מושגת על ידי הפעלת איתות WNT קנוני באמצעות מעכב GSK3 CHIR99021, ואחריו FGF9/הפרין. מיום 0 עד יום 4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחבים במהירות ומקבלים צורות רומבואידיות או משולשות. המפגש מגיע ל-90%-100% ומצטבר באופן שווה עד היום השביעי. בתרבית ההשעיה, הצברים יוצרים באופן ספונטני מבני נפרון לאחר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing iPSC Differentiation for Efficient Production to Generate Kidney Organoids at JoVE.com

פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.

Kidney organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through various approaches. These organoids hold great promise for disease ...

המחקר שלנו מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, תוך שימוש בתנאי תרבית תרחיף. אנו מדגישים את החשיבות של צפיפות תאים ראשונית וריכוז אגוניסט WNT בשלב הזירוז, אשר יחנך חוקרי אורגנואידים חדשים. נכון לעכשיו, קשה להשיג קו תאים יחיד בצפיפות גבוהה עבור iPSCs.השפעת האצווה הייתה מורגשת, במיוחד בקווי iPSC שונים. אורגנואידי הכליה של כל אצווה, עשויים להיות בעלי צורה וגודל מגוונים. יש צורך במספר ניסיונות כדי לקבל את צפיפות התאים והריכוז הראשוניים הטובים ביותר של CHIR עבור קו iPSC אחד.קבענו כי ההבחנה הראשונית של שיטת המתווך חשובה ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות. הפרוטוקול שלנו מתאר בפירוט כיצד לבחור את צפיפות התאים האופטימלית ואת ריכוזי ה- CHIR במהלך התהליך מכיוון שקווי iPSC שונים הראו שונות ביכולת התרבות והתמיינות התא. חוקרים יכולים ליצור במהירות אורגנואידים ספציפיים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שלהם.על פי הפרוטוקול שלנו, על ידי התאמת צפיפות התאים וריכוז CHIR, ללא ספק מועיל לכל החוקרים שלנו להתמקד במחלת הכליות שלהם. המחקר העתידי שלנו במעבדה צריך לייעל את שיטת הפרוטוקול במודלים של מחלות, לחדש את הרפואה החדשה ואת בדיקת התרופות. בחמש השנים האחרונות תתמקד מעבדתנו באפיגנטיקה ובפיתוח תרופות למחלות כליות תורשתיות שונות, המבוססות על התפתחות החולה, iPSC ומודלים של מחלות מאורגנות בכליות.

יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

Abstract