Визуализация кальция в электрически стимулированной плоской сетчатке

Summary

Протезы сетчатки обладают способностью генерировать зрительное восприятие. Для продвижения разработки новых протезов необходимы методы ex vivo для тестирования устройств перед имплантацией. В данной статье представлен комплексный протокол исследования активности кальция в слое ганглиозных клеток сетчатки при электростимуляции.

Abstract

Дистрофии сетчатки являются основной причиной слепоты во всем мире. В настоящее время предпринимаются обширные усилия по разработке усовершенствованных протезов сетчатки, которые могут обходить поврежденные светочувствительные фоторецепторные клетки в дегенеративной сетчатке, с целью частичного восстановления зрения путем индуцирования зрительных восприятий. Одним из распространенных направлений исследований является разработка и производство имплантируемых устройств с гибкой физической структурой, содержащих большое количество электродов. Это позволяет эффективно и точно генерировать визуальные восприятия. Тем не менее, с каждым технологическим достижением возникает потребность в надежном и управляемом методе ex vivo для проверки функциональности устройства, прежде чем переходить к экспериментам in vivo , где в игру вступают факторы, выходящие за рамки производительности устройства. В данной статье представлен комплексный протокол исследования активности кальция в слое ганглиозных клеток сетчатки (ГКЛ) после электростимуляции. В частности, описаны следующие этапы: (1) флуоресцентная маркировка сетчатки крысы с использованием генетически кодируемых кальциевых индикаторов, (2) захват флуоресцентного сигнала с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с применением различных паттернов электрической стимуляции и (3) извлечение и анализ следов кальция из отдельных клеток внутри ГКЛ. Следуя этой процедуре, исследователи могут эффективно тестировать новые протоколы стимуляции перед проведением экспериментов in vivo .

Introduction

Сетчатка содержит фоторецепторы, которые являются клетками, отвечающими за восприятие света. Они улавливают фотоны и преобразуют их в нервные импульсы. Затем эти импульсы обрабатываются в сетчатке и передаются в зрительную кору, в результате чего формируется зрительный образ^. Пигментный ретинит (РП) и возрастная макулярная дегенерация (ВМД) являются дегенеративными заболеваниями, характеризующимися прогрессирующей потерей фоторецепторов. Эти ретинопатии являются одной из ведущих причин слепоты во всем^мире1, затрагивая миллионы людей и имея значительные медицинские, личные и социально-экономические последствия для пациентов, систем здравоохранения и общества в целом. Кроме того, в связи со старением населения прогнозируется, что к 2050 г. число случаев заболевания ВМД увеличится на 15%².

В настоящее время проводятся многочисленные исследования по восстановлению зрения у пациентов, страдающих этими состояниями³. Одним из перспективных подходов является использование протезов сетчатки, которые продемонстрировали эффективность в частичном восстановлении зрения ^4,5. Эти устройства улавливают свет из визуальной сцены и преобразуют его в электрические импульсы. Эти импульсы доставляются через электроды внутри микроэлектродной матрицы (МЭА), имплантированной в глаз, стимулируя выжившие нейроны и обходя функцию потерянных фоторецепторов. Активированные ганглиозные клетки сетчатки (RGC) передают выходные данные в мозг, где они интерпретируются как зрительное восприятие. Однако основные ограничения современных имплантатов заключаются в разрешении интерфейса^{электрод-ткань 6} и неселективной стимуляции различных типов клеток. Поэтому для оптимизации конструкции новых имплантируемых устройств для более эффективного восстановления зрения крайне важно понять, как можно разработать парадигмы стимуляции для селективной активации клеток в непосредственной близости от электродов.

Визуализация кальция является широко используемым методом изучения нейронной активности, имеющим ряд преимуществ по сравнению с неоптическими методами ^7,8. Во-первых, он обеспечивает клеточное и субклеточное разрешение. Во-вторых, кальциевые маркеры могут быть нацелены на определенные типы клеток. В-третьих, это позволяет осуществлять долгосрочное отслеживание, и, в-четвертых, позволяет наблюдать за целыми клеточными популяциями, различая активные и неактивные клетки. Этот метод дает косвенные доказательства клеточной активности с временным разрешением в диапазоне сотен миллисекунд. Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы кальция, такие как датчики GCaMP, претерпевают конформационные изменения при связывании с кальцием, что приводит к увеличению флуоресценции⁹. Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ) являются эффективным средством трансдуцирования клеток сетчатки с помощью GCaMP¹⁰.

Этот протокол представляет собой эффективный метод, который использует визуализацию кальция для тестирования протоколов стимуляции имплантатов сетчатки. В частности, мы фокусируемся на тканях сетчатки крыс ex vivo и предоставляем подробные пошаговые инструкции, от сбора образцов до анализа данных. Предложив это подробное руководство, исследователи из разных областей могут с уверенностью приступить к экспериментам с электростимуляцией.

Protocol

Все процедуры с животными проводились в соответствии со стандартными этическими нормами для животных (Директива Европейских сообществ 86/609/EU) и одобрены местными комитетами по этике животных. Для настоящего исследования были использованы 8-недельные крысы породы Лонг Эванс. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка носителя и плоская монтажная сборка

1. Ames' Medium (1 л)
   1. В стеклянной бутылке объемом 1 л смешайте порошок Ames' Medium, 1,9 г/л NaHCO₃, 10 мл пенициллина/стрептомицина 100x и 1 л деионизированной воды (см. таблицу материалов). Отрегулируйте pH до 7,4 и осмолярность до 280 мОсм с помощью деионизированной воды или NaHCO₃. Простерилизуйте раствор, процедив его через фильтр с размером пор 0,2 мкм под колпаком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните стерилизованную среду при температуре 4 °C. Этот раствор остается стабильным и может использоваться до 1 месяца.
2. Монтаж мембран
   1. Прикрепите одну пористую мембрану из ПТФЭ (см. Таблицу материалов) к шайбе с помощью небольших капель клея. Дайте ему высохнуть не менее 15 минут.
   2. Для достижения прозрачности погрузите мембраны в 70% этанол на 1 мин.
   3. Дважды промойте мембраны деионизированной водой, чтобы полностью удалить этанол. Храните их в деионизированной воде, чтобы предотвратить помутнение.

2. Маркировка GCL и плоское крепление сетчатки крысы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод мечения не дифференцирует RGC от вытесненных амакриновых клеток. Если требуется селективное мечение RGC, рассмотрите возможность использования AAV с RGC-специфичными промоторами¹¹ и/или ретроградным мечением через зрительный нерв¹². Для различения классов ON- и OFF-center RGC классифицируйте RGC на основе их светового отклика^13,14 и используйте новые версии генетически кодируемых индикаторов кальция, которые обеспечивают повышенную чувствительность и способность измерять одиночные потенциалы действия¹⁵.

1. Интравитреальные инъекции
   1. Обезболивайте 8-недельную крысу Лонга Эванса 2% изофлураном/1%_О2 до тех пор, пока педальный рефлекс не исчезнет, и поддерживайте анестезию с помощью носовой маски крысы (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анестезии положите животное на грелку, чтобы поддерживать температуру тела.
   2. Введите одну каплю имеющихся в продаже глазных капель (см. таблицу материалов), чтобы расширить зрачок.
   3. Прежде чем приступить к операции, осмотрите глаз на наличие аномалий с помощью глазного дна и оптической когерентной томографии (ОКТ) с системой визуализации сетчатки in vivo . Нанесите одну каплю Метоцеля 2% для облегчения контакта с роговицей (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении каких-либо аномалий не приступайте к дальнейшим действиям для этого глаза.
   4. Применяют одну каплю Прескаина в качестве местного анестетика. Зафиксируйте веко и лимбальную конъюнктиву с помощью имеющейся в продаже шовной нити (см. Таблицу материалов). Создайте склеротомию 1 мм в 4 мм от лимба с помощью иглы 30 G.
      1. Прикрепите тупую иглу 36 G к прецизионному шприцу и введите частицы AAV, несущие генетически закодированный кальциевый индикатор, в стекловидное тело в течение 30 секунд под углом 45°. В данном исследовании мы использовали AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 10¹¹ GC/мл в HBSS) (см. таблицу материалов).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкции AAV, которые не кодируют потенциально опухолегенные генные продукты или молекулы токсинов и производятся без вируса-помощника, могут обрабатываться на объектах уровня биобезопасности 1 (BSL-1). В противном случае, если он считается биологически опасным материалом в условиях содержания BSL-2, должны быть приняты надлежащие меры предосторожности¹⁶. AAV, кодирующие GCaMP, считаются BSL-1 и не требуют манипуляций под шкафами биобезопасности.
   5. Применяют одну каплю Тобрадекса (см. Таблицу материалов) для предотвращения воспаления и в качестве антибиотикопрофилактики.
   6. При желании повторите шаги 2, 3 и 4 с другим глазом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите животных через 12-24 часа после операции, чтобы убедиться в отсутствии побочных реакций.
   7. Через три дня после инъекции исследуйте структуру сетчатки с помощью фундоскопии и ОКТ с помощью системы визуализации сетчатки in vivo (см. таблицу материалов).
   8. Через две недели после инъекции ГКЛ должен излучать флуоресценцию. Оценка структуры сетчатки и экспрессии AAV с помощью флуоресцентной фундоскопии с использованием системы визуализации сетчатки in vivo .
      ПРИМЕЧАНИЕ: По данным Weitz et ^al.12, флуоресценция от AAV2-CAG-GCaMP5G становится заметной через 1 неделю после инъекции и усиливается через 2 недели. Начиная с четвертой недели, гиперэкспрессия GCaMP индуцирует цитоморбидность. Умирающие клетки демонстрируют высокий базовый сигнал флуоресценции в ядре и цитоплазме, который не колеблется в ответ на стимуляцию. В здоровых клетках экспрессия GCaMP ограничена цитоплазмой и исключена из ядра 7,8,12,17,18. Эти особенности можно наблюдать ex vivo во время микроскопической визуализации. Окно экспрессии гена может варьироваться в зависимости от вирусного вектора и выбранного промотора.
2. Иссечение сетчатки и плоское крепление
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через две-три недели после инъекции крыс, получивших интравитреальные инъекции, усыпляют непосредственно перед началом протокола электрофизиологии в соответствии со стандартными этическими рекомендациями (Директива Европейского сообщества 86/609/EU) и одобрены местными этическими комитетами. В качестве метода эвтаназии в этом протоколе используется ингаляция углекислого газа (_СО2).
   1. Энуклеация глаз
      1. Осторожно надавите на внешнюю сторону глазницы с помощью пары изогнутых щипцов, чтобы слегка вытоптать глаз из глазницы.
      2. Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать мышцы, удерживающие глаз, и энуклеировать его, стараясь не проколоть глазное яблоко.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, препарируйте сетчатку под стереомикроскопом в оксигенированной (95% O₂ / 5% CO₂) среде Эймса.
   2. Иссечение сетчатки
      1. Используйте небольшие изогнутые щипцы и тонкие пружинные ножницы, чтобы удалить все окружающие ткани из глазного яблока.
      2. Возьмите кусок фильтровальной бумаги размером примерно 3 см х 3 см и положите его на крышку посуды диаметром 3,5 см. Смочите бумагу средством Эймса.
      3. Поместите глазное яблоко поверх бумаги так, чтобы передний сегмент был обращен к оператору. Используйте прямые щипцы, чтобы удерживать глазное яблоко, расположив их поверх ora serrata под углом примерно 45° от поверхности чашки. Сделайте небольшой надрез лезвием, используя пространство между прямыми щипцами в качестве ориентира.
      4. Возместите глазное яблоко в медиуме Эймса. Используйте прямые щипцы и тонкие пружинные ножницы, чтобы разделить передний и задний сегменты глаза.
      5. Осторожно извлеките линзу с помощью двух пар прямых щипцов. Затем отделите сетчатку от склеры.
      6. Разрежьте склеру по направлению к зрительному нерву тонкими пружинными ножницами до тех пор, пока сетчатка не будет изолирована от наглазника.
      7. Используйте флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы определить область сетчатки с наилучшей индикаторной экспрессией кальция.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Степень распространения вируса зависит от успешности интравитреальной инъекции. Достижение флуоресценции на больших участках сетчатки может потребовать практики. Опыт исследователя играет решающую роль в получении оптимальных результатов.
      8. С помощью пластиковой пипетки с обрезанным наконечником перенесите выбранный кусочек сетчатки на монтажную мембрану (этапы установки мембран). Используйте прямые щипцы, чтобы прикрепить сетчатку плоской поверхностью вверх.
      9. С помощью пластиковой пипетки, прикрепленной к наконечнику для пипетки на 100 мкл, извлеките носитель, чтобы кусочек сетчатки прилип к пористой мембране. Переверните узел на MEA так, чтобы GCL опирался на электроды.
      10. Наполните ванну с образцом насыщенной кислородом средой Эймса.

3. Визуализация кальция ex vivo при электростимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе для экспериментов ex vivo был использован экспериментальный МЭА. Изготовленные на заказ МЭА были изготовлены из пористых электродов на основе графена диаметром 25 мкм на боросиликатном стекле толщиной 500 мкм с следами Ti/Au, а затем изолированы нитридом кремния и фоторезистом^{SU-8 12}. Тем не менее, методы визуализации кальция эффективны независимо от материала электрода, используемого для стимуляции.

1. Настройте систему перфузии таким образом, чтобы насыщенная кислородом среда Эймса постоянно перфузирует ванну с образцом при температуре 33 °C при постоянном расходе 5 мл/мин.
2. С помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного люминесцентной лампой, кубом-фильтром FITC и КМОП-камерой, осмотрите сетчатку на предмет области, где видны стимулирующие электроды и флуоресценция клеток, экспрессирующих GCaMP. Для этого исследования был использован 20-кратный воздушный объектив NA 0.75.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной стимуляции (и регистрации) клеток с помощью электродов сетчатка и электрод должны находиться в тесном контакте. Таким образом, ячейки визуально находятся в той же фокальной плоскости, что и электроды. Если это не так, повторите шаги по удалению сетчатки, начиная с шага 8. При использовании сетчатки на здоровых животных моделях (с функционирующими фоторецепторами) обратите внимание, что каждый раз, когда люминесцентная лампа включается, свет генерирует некоторые вызванные отклики, поскольку сетчатка светочувствительна к длине волны, используемой для возбуждения датчика GCaMP. Эти изменения кальция, вызванные светом, могут быть использованы для оценки состояния здоровья тканей. Чтобы избежать смешивания света с электрическими реакциями, включите люминесцентную лампу не менее чем за 1 минуту до начала получения изображения.
3. Чтобы вызвать электрические отклики в ГКЛ, выберите электрод для отправки импульсов, управляемых током. Задайте параметры электростимуляции в программном обеспечении генератора импульсов, такие как: форма, амплитуда, длительность, фазовая задержка и частота подаваемых импульсов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективные параметры стимула могут варьироваться в широких пределах от длительности импульса от 50 мкс до 100 мс с амплитудами от 0,1 мкА до 10 мкА. Эти параметры, наряду с частотой стимулов, полярностью стимулов, числом импульсов и межфазными задержками, могут влиять на пространственно-временную реакцию, наблюдаемую при визуализации кальция 19,20,21,22. Последовательность из 40 двухфазных импульсов, обеспечивающих стимуляцию 1 мс, 2 мкА, часто вызывает видимый отклик в меченых нейронах.
4. Чтобы синхронизировать получение изображения с подачей стимуляции, используйте генератор импульсов в качестве внешнего триггера для управления началом получения изображения. Подключите камеру (см. Таблицу материалов) к генератору импульсов с помощью выходного сигнала запуска и установите для параметра «Режим съемки» программного обеспечения фотокамеры значение «Запуск внешнего запуска». Нажмите кнопку Старт в программном обеспечении камеры, чтобы дождаться запуска внешнего триггера. Начните получение изображения с помощью программного обеспечения генератора импульсов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внешний триггер может быть настроен по-разному для разных камер. В этом исследовании обычно получали изображения (512 x 512 пикселей, 16-битные оттенки серого) с частотой 10 кадров в секунду в течение 1 минуты, обеспечивая при этом всплески двухфазных импульсов каждые 10 с. Подача импульса начинается через 10 с, поэтому первые кадры во всех экспериментах соответствуют спонтанной активности. В зависимости от датчика GCaMP и анализа, который он будет выполнять, может потребоваться отрегулировать скорость записи в соответствии со временем нарастания и затухания вашего кальциевого индикатора⁸. Учитывают чувствительность для обнаружения потенциалов одиночного действия кальциевого индикатора¹⁵.
5. Сохраните изображения с именем файла, содержащим примененные параметры электростимуляции, например [Номер электрода]_[Амплитуда импульса]_[Длительность импульса]_[Частота импульса]_Image001.

4. Анализ данных

1. ImageJ/FIJI для извлечения профиля интенсивности флуоресценции во времени и пространственных координат из сом клеток
   1. Сегментируйте область интереса (ROI) с помощью «Инструментов выбора области» и добавьте ее в Диспетчер ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). В меню ROI Manager сохраните его в папке .zip (Дополнительно > Сохранить).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, одни и те же ROI могут быть применены ко всем экспериментам по стимуляции, поскольку они соответствуют одному и тому же FOV.
   2. Выберите «Среднее значение серого» в качестве параметра для извлечения (Анализ > Установка измерений).
   3. Извлеките «Среднее значение серого» из сомы ячейки, нажав кнопку «Еще» > «Мультимера». Появится диалоговое окно. Включите параметры Измерить все 600 срезов и Одна строка на срез , чтобы получить единую таблицу, в которой столбцы соответствуют рентабельности инвестиций, а строки — временным рамкам. Сохраните созданную таблицу в виде .xls электронной таблицы.
   4. Выберите "Centroid" в качестве параметра для извлечения (Analyze > Set measurements).
   5. Извлеките «Центроид» из ROI, нажав кнопку Measure. Сгенерированная таблица соответствует координатам (X,Y) ROI. Сохраните его как .xls электронную таблицу.
2. Специально разработанный сценарий для идентификации клеток, реагирующих на стимулы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был использован MATLAB (см. Таблицу материалов), но описанные шаги могут быть выполнены на любом языке программирования. Пользователи могут получить наш пользовательский скрипт, запросив соответствующего автора.
   1. Коррекция эффекта фотообесцвечивания: Чтобы смягчить эффект фона и фотообесцвечивания, возьмите 15-20 кадров из нестимулирующих периодов перед каждой серией и подгоните их к линейной кривой [Подгонка (поли1)].
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае для 600-кадрового фильма, в котором периодические всплески импульсных последовательностей посылались каждые 10 с, кадры 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 считались нестимулирующими периодами.
   2. Нормализуйте по формуле: (Х-мин) / (макс-мин)
   3. Идентификация реагирующих клеток
      1. Вычислите среднеквадратичное значение (RMS) нестимулирующих периодов по нормализованным данным. Это будет считаться базовым сигналом.
      2. Вычислите максимум стимулирующих периодов (промежутков между нестимулирующими периодами). В этом случае для 600-кадрового фильма, в котором периодические всплески импульсов посылались каждые 10 с, кадры 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 считались стимулирующими периодами.
      3. Если максимальное значение превышает базовый сигнал в 2,5 раза для определенного ROI, пометьте ячейку как отвечающую на этот стимулирующий период. Если клетка реагирует на три из пяти стимулирующих периодов, классифицируйте ее как реагирующую клетку.

Discussion

Описанный здесь протокол служит для изучения динамики кальция, происходящей в ГКЛ сетчатки крысы при электростимуляции с помощью МЭА. Это надежный и управляемый метод, но он требует некоторой подготовки, в частности, для равномерной эффективной маркировки GCL и правильной установки сетчатки для обеспечения оптимального контакта ткани с электродом. Этот протокол специфичен для грызунов и должен быть адаптирован при применении к другим лабораторным видам. Подробно представлены критические моменты, модификации и ограничения методологии.

Интравитреальные инъекции
Инъекции широко используются для доставки глазных генов, при этом интравитреальные инъекции являются предпочтительной процедурой. Было доказано, что они более безопасны и менее инвазивны по сравнению с субретинальными инъекциями, которые вводят интересующие молекулы непосредственно между фоторецепторами и пигментным эпителием сетчатки (РПЭ), рискуя отслойкой сетчатки¹⁰. Однако существуют ограничения, особенно при выполнении этих инъекций на моделях грызунов. Стекловидное тело желеобразное, препятствующее распространению вируса. Более того, хрусталик в глазах грызунов большой, что делает нетривиальным введение иглы, не поцарапав ее. Иглы прецизионных шприцев чувствительны и нуждаются в частой замене. Чтобы предотвратить засорение, мойте их деионизированной водой до и после каждого использования и регулярно заменяйте. Кроме того, вводите содержимое медленно, чтобы предотвратить рефлюкс раствора и изменения внутриглазного давления. Для достижения большой и равномерной флуоресценции по всей сетчатке может потребоваться практика.

Трансдукция клеток сетчатки
Вирусные векторы являются отличным методом доставки генов in vivo, а AAV широко используются для трансдукции клеток сетчатки¹⁰. Они были одобрены в качестве лечения некоторых ретинопатий, вызывающих слепоту человека²⁴. Однако их несущая емкость ограничена 5 кб, включая необходимые регулирующие элементы (например, промоутер)^10,25. Существует несколько серотипов, каждый из которых обладает различным тропизмом. Выберите наиболее подходящий AAV в зависимости от генов, которые необходимо доставить, и клеток, которые необходимо трансдуцировать²⁶. Для маркировки RGC рекомендуется использовать AAV2²⁷.

Окно экспрессии генов
Оптимальная вирусная экспрессия для AAV2-CAG-GCaMP5G составляет 2-3 недели после инъекции^12,18. По истечении этого времени ядра трансфицированных клеток становятся флуоресцентными, клетки перестают реагировать на стимулы и, в конечном счете^{, погибают.} Это связано с гиперэкспрессией индикатора GCaMP, который транслоцируется в ядро. Временное окно для оптимальной экспрессии гена будет варьироваться в зависимости от вирусного вектора и выбранного промотора³⁰ и должно быть определено экспериментально, прежде чем приступить к этому протоколу.

Тканево-электродный контакт
Для достижения оптимальных и воспроизводимых результатов решающее значение имеет достижение хорошего контакта между тканью и электродом. Плохой контакт, как правило, обусловлен естественной кривизной сетчатки. Один из подходов заключается в том, чтобы разрезать сетчатку на четвертинки, смонтировать и сделать снимок по одному участку за раз. Небольшие участки сетчатки могут быть лучше уплощены, что приводит к более эффективному контакту с поверхностью МЭА. Еще одной потенциальной причиной плохого контакта является наличие стекловидного тела. При проведении экспериментов по стимуляции, имитирующей эпиретинальный имплантат, важно осторожно удалить стекловидное тело во время иссечения сетчатки, так как оно может действовать как изолятор для тока. Здесь описан простой метод проверки достаточности контакта путем визуализации электрода и ячеек в одной фокальной плоскости.

Альтернативой измерениям на сетчатке ex vivo является выращивание нейронов непосредственно на поверхности электродов. Первичная культура нейронов, таких как нейроны гиппокампа³¹, может быть полезна для первоначальных тестов для оценки функциональности нового стимулирующего устройства. Однако этот подход по-прежнему требует использования лабораторных животных и не отражает сложность сети сетчатки, которая важна для оценки синаптических реакций на стимуляцию.

Для визуализации ячеек под электродом и электродных дорожек можно использовать МЭА, изготовленные из прозрачных материалов, таких как оксид индия-олова (ИТО) 19,20,32. В дополнение к оптическим измерениям, активность GCL при электростимуляции может быть оценена с помощью электрических записей. МЭА может быть использован для регистрации потенциала локального поля (LFP) ткани. Однако это ставит под угрозу пространственное разрешение, так как каждый электрод захватывает активность нескольких ячеек одновременно (в зависимости от размеров электрода). Оптическая запись преодолевает это ограничение и обеспечивает картографирование с более высоким пространственным разрешением. Его основным преимуществом является способность различать активные и неактивные ячейки при измерении большого поля зрения с разрешением одной ячейки. Среди всех исследователей клеточной активности индикаторы кальция хорошо описаны и наиболее часто используются³³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x NA 0.75 S Fluor air objective	Nikon	CFI Super Fluor 20X	-
3.5 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-90	-
30 G needle	VWR	613-5373	-
36 G blunt needle	World Precision Instruments	NF36BL-2	-
6 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-94	-
AAV2-CAG-GCaMP5G	Vector Biolabs	-	-
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420	-
Blade	Swann-morton	0308	-
Camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0	-
Carbogen	Air liquide	-	-
Curved-forceps	-	-	-
Fine spring-scissors	FST	91501-09	-
FITC filter cube	Nikon	Standard series	-
Fluorescent lamp	Nikon	C-HGFI	-
Fluorescent stereomicroscope	Nikon	SMZ25	-
HBSS	Capricorn	HBSS-1A	-
ImageJ/FIJI	NIH	v1.50i	-
In vivo retinal imaging system	Phoenix Research Laboratories	Micron III	-
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti	-
Isofluorane	Arrane Baxter Laboratories	-	-
Long-Evans rat	Janvier	-	-
MATLAB (Version R2021b)	Mathworks	-	-
Media filters	Merckmillipore	SCGPS02RE	-
Methocel 2%	Omni Vision	-	-
Microelectrode array (MEA)	-	Custom-made
NaHCO3	Thermofisher	42427	-
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermofisher	15140122	-
Phenylephrine	Alcon Cusí Laboratories	653437.3	100 mg/mL
Plastic pipette	VWR	612-1793	-
Porous membrane	Merckmillipore	#JVWP01300	-
Precision syringe	World Precision Instruments	10 µl Nanofil	-
Prescaina	Llorens	-	Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic
Rat nasal mask	Xenotec	XRK-RA	-
Small curved-forceps	Bbraun	AESCBD311R	-
Spring-scissors	FST	15040-11	-
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000	-
Straight forceps	FST	11252-20	-
Suture filament	Vitrex Medical	4328	Nilon monofilament, 7/0, DS12
Tobradex	Alcon Cusí Laboratories	-	Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL)
Tropicamide	Alcon Cusí Laboratories	653486	10 mg/mL
Washer	Thorlabs	W8S038	-