חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

Summary

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

Abstract

שרירי השלד הם סינסיטיה גדולה המורכבת ממיופיבים צרורים רבים המייצרים כוחות ומאפשרים תנועת גוף. דרוזופילה היא מודל קלאסי לחקר ביולוגיה של שרירים. השילוב של גנטיקה של דרוזופילה וגישות אומיקה מתקדמות הוביל לזיהוי מולקולות מפתח שמורות המווסתות מורפוגנזה והתחדשות שרירים. עם זאת, דינמיקת השעתוק של מולקולות אלה וההתפלגות המרחבית של הרנ"א השליח שלהן בתוך הסינקיטיה אינן ניתנות להערכה בשיטות קונבנציונליות. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה קיימת של RNA פלואורסצנטי באתרו (smFISH) של מולקולה בודדת כדי לאפשר זיהוי וכימות של מולקולות mRNA בודדות בתוך שרירי תעופה בוגרים ותאי גזע השריר שלהם. כהוכחת היתכנות, ניתחנו את ביטוי ה-mRNA ואת התפלגות שני גורמי שעתוק אבולוציוניים שמורים, Mef2 ו-Zfh1/Zeb. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לזהות ולכמת ביעילות מולקולות mRNA בודדות עבור שני התעתיקים בתאים מקדימים של שריר, שרירים בוגרים ותאי גזע שריר.

Introduction

שרירי השלד הבוגרים עשויים מסיבים מרובי גרעינים מובחנים שתכונות ההתכווצות שלהם מייצרות תנועות. גדילה, תחזוקה והתחדשות שרירים מסתמכים על אבות שריר ותאי גזע שריריים (MuSCs) המוגדרים במהלך ההתפתחות העוברית¹. התוכנית המיוגנית נשלטת היטב על ידי קבוצה של גורמי שעתוק מיוגני ליבה (TFs) (למשל, Pax3/7, MYOD, Mef2 ו- ZEB)^2,3,4. פענוח המנגנונים המולקולריים המווסתים את הביולוגיה של השרירים חשוב להבהרת שאלות יסוד הקשורות למיולוגיה ולשימוש טיפולי אפשרי בטיפול במחלות ניווניות שרירים.

לדרוזופילה יש היסטוריה ארוכה כמודל גנטי לחקר מיוגנזה⁵. לאחרונה הוא התגלה כמודל חדש לחקר התחדשות שרירים ^6,7,8. מבנה השרירים ותוכניות הליבה המיוגניות נשמרים מאוד בין זבובים ליונקים. לדוגמה, ל-TFs Mef2 ו-Zfh1/ZEB יש תפקיד שמור בוויסות התפתחות והתחדשות שרירים 3,9,10,11. שרירי דרוזופילה בוגרים, כגון שרירי הטיסה העקיפה (IFMs), נוצרים מאוכלוסייה ספציפית של MuSCs, המכונים אבות שרירים בוגרים (AMPs)¹². AMPs אלה מוגדרים במהלך האמבריוגנזה וקשורים למבני אפיתל כגון דיסקים בכנף וברגליים. לאורך כל שלבי העובר והזחל, AMPs נשארים בלתי ממוינים עד למטמורפוזה כאשר הם עוסקים בהתמיינות ואיחוי ליצירת IFMs^13,14. TF Spalt major (spalt, salm) מתבטא במהלך התפתחות שרירי הטיסה ויש צורך לקבוע את זהותם המבנית¹⁵. Mef2 הוא TF מיוגני חשוב נוסף החיוני ליצירת שרירים בוגרים^16,17. זה בא לידי ביטוי AMPs ונשמר במבוגרים IFMs^10,18. בעוד שרוב ה-AMPs מתמיינים לשרירים פונקציונליים, תת-קבוצה חומקת מהתמיינות ויוצרת את MuSCs¹¹ הבוגרים. בדומה לבעלי חוליות, TF Zfh1/ZEB נדרש כדי למנוע התמיינות מוקדמת של MuSCs בוגרים ולשמור על גזעם ^9,10.

דינמיקה של ביטוי גנים הוכחה כמווסתת תהליכים ביולוגיים שונים של שרירים^19,20. הופעתן של טכניקות ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני בתפוקה גבוהה אפשרה חקירה מקיפה של דינמיקות שעתוק אלה^21,22. מגבלה בולטת אחת של גישות אלה היא חוסר יכולתן לספק את הפיזור המרחבי של מולקולות mRNA בסיבי השריר מרובי הגרעין. תכונות אלה יכולות להיחקר על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו של מולקולה בודדת (smFISH) החושפת שני סוגים של גופי mRNA: 1. מולקולות mRNA בודדות המפוזרות בציטופלסמה ומייצגות את הרנ"א הבוגר ו-2. שני מוקדים גרעיניים בהירים לכל היותר תואמים את התעתיק המתהווה וחושפים את האללים הפעילים בשעתוק²³. לכן, smFISH היא שיטה מועדפת לכימות מולקולות mRNA בודדות, החוקרת את ההתפלגות המרחבית שלהן ומספקת תמונות של דינמיקת השעתוק של הגנים.

שיטת smFISH מסתמכת על סדרה של בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות קצרות שתוכננו במיוחד כדי להיות משלימות את תעתיק המטרה. עם החישול, הוא מייצר מקורות נקודתיים בעוצמה גבוהה המאפשרים זיהוי של mRNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי²⁴. שיטה זו מיושמת יותר ויותר עבור מגוון רחב של סוגי תאים, כולל רקמות שריר יונקים^19,20. עם זאת, בדרוזופילה, כמו במודלים אחרים של בעלי חיים, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, אשר חסרות מידע כמותי על המיקום המרחבי של מולקולות mRNA. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מבשרי שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים^23,25. פרוטוקול זה כולל צינור ניתוח אוטומטי לחלוטין עבור סגמנטציה של גרעינים וספירת mRNA ולוקליזציה.

Protocol

1. דיסקציה והכנה של דיסק כנף ושרירים בוגרים

הערה: נקה את ספסל הדיסקציה ואת כל מכשירי הדיסקציה באמצעות תמיסת מעכבי RNAse (טבלת חומרים). יש ללבוש כפפות מעבדה במהלך כל הליך הניסוי.

1. דיסק כנף
   1. הניחו את הזחלים המבוימים L3 במי מלח קרים חוצצי פוספט 1x (PBS) (איור 1A).
   2. שטפו את הזחלים 3x עם 1x PBS ושמרו אותם בתמיסה זו למשך 5 דקות.
   3. בעזרת שני זוגות מלקחיים חדים, מחזיקים את הזחל מהחלק הקדמי ומושכים ומשליכים את שאר רקמות הגוף (בסביבות 2/3).
   4. החזיקו את 1/3 הזחל הראשון עם זוג מלקחיים אחד ואת ווי הפה עם הזוג השני. משכו את ווי הפה בתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין.
      הערה: נתח כ-30 זחלים בכל ניסוי, כדי להבטיח גודל מדגם מתאים לניתוח.
   5. שימו לב שדיסקיות הכנף קשורות קשר הדוק לשני הענפים העיקריים של קנה הנשימה, העוברים לאורך כל צד של הזחל.
   6. הסירו את כל מרכיבי הזחל האחרים (דיסקיות רגליים ומוח) כדי לקבל פגר זחל הפוך ונקי עם זוג דיסקיות כנף המחוברות לקנה הנשימה (איור 1B).
   7. הניחו את הדגימות בצינור צנטריפוגה בנפח 1 מ"ל וקיבעו אותן ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מדולל ב-1x PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.
      הערה: תסיסה לדוגמה מושגת על ידי מערבל מתנדנד (טבלה של חומרים).
   8. לשטוף את הדגימות 3 x 5 דקות עם אתנול 70% (EtOH, מדולל במים ללא RNAse) ולאחסן אותם באותה תמיסת כביסה ב 4 ° C לפחות 2 ימים ועד 1 שבוע.
2. שרירי טיסה עקיפים
   1. הרדימו את הזבובים הבוגרים על משטח זבוב_CO2 והסירו את הראשים, הבטן, הרגליים והכנפיים.
   2. הניחו את בית החזה המנותח ב-PBS 1x קר והמשיכו לעשות זאת עד שכל הדגימות ינותחו (איור 1D).
   3. מקדמים את בית החזה ב-4% PFA, (1% טריטון) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.
   4. שטפו את הדגימות 3 x 5 דקות עם תמיסת כביסה 1x PBT (1% טריטון ב-1x PBS).
   5. מקמו את בית החזה על סרט דו-צדדי (Table of Materials) על מגלשת זכוכית וחתכו אותם עם להב מיקרוטום חד כדי לייצר שני המי-תורקסים (איור 1E,F).
   6. תקן את הדגימות ב 4% PFA (1% טריטון) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.
   7. יש לכבס 2 x 20 דקות עם תמיסת כביסה PBT אחת (1% טריטון, 1x PBS) בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.
   8. הניחו את המי-תוראס ב-PBS 1x קר והשתמשו במלקחיים כדי לבודד בעדינות את ה-IFMs מההמי-תוראס (איור 1G).
      הערה: כדי להשיג זאת, חשוב להסיר את הקוטיקולה ביסודיות ככל האפשר.
   9. כדי לחלחל את הדגימות, לאחסן את IFMs מבודדים בתמיסת 70% EtOH לפחות 2 ימים ועד שבוע אחד ב 4 ° C.
      הערה: בודד את ה- IFMs מכ- 10 בתי חזה לכל ניסוי כדי להבטיח גודל מדגם מתאים לניתוח.

2. הכלאה, אימונוסטיין והרכבה

הערה: הליך הכלאה דומה מיושם הן עבור דיסקיות כנף והן עבור דגימות IFMs. חשוב מאוד לבודד את דיסקיות הכנף מפגרי הזחלים ולהכניס אותן ל-200 מיקרוליטר של חיץ A לפני תחילת ההכלאה.

1. השהה מחדש את הגשושיות ב 400 μL של חיץ TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) לקבלת פתרון מלאי סופי של 12.5 מיקרומטר.
2. מעבירים את הדגימות לצינור צנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל המכיל חיץ A (טבלת חומרים).
   הערה: על ידי הקטנת נפח המיכל, קל יותר לדמיין את הדגימות ולהימנע מאיבודן במהלך תהליך הכביסה.
3. שטפו את הדגימות 2 x 20 דקות עם Buffer A.
4. שאפו את חיץ A, החליפו אותו ב-400 μL של חיץ ההכלאה (Table of Materials), ובצעו הכלאה מוקדמת של הדגימות למשך 30 דקות ב-37°C במערבל תרמי (Table of Materials).
5. מדללים את הגשושיות לריכוז סופי של 125 ננומטר לדיסקיות כנף ו-200 ננומטר לשרירים בוגרים, במאגר ההכלאה ומוסיפים את הנוגדן הראשוני.
   הערה: דילול הנוגדנים משתנה בהתאם לנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש (רשימת חומרים). הוספת נוגדנים היא אופציונלית. משתמשים יכולים לבחור לוותר על צביעת חלבונים ובמקום זאת להשתמש בפרוטוקול smFISH דומה שאינו כולל תוספת נוגדנים.
6. שאפו את חיץ ההכלאה והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטר של חיץ הכלאה המכיל את הבדיקה ואת הנוגדן.
7. יש לדגור על הדגימות בחושך בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות לפחות מתחת ל-300 סל"ד במערבל תרמי.
8. חימום aliquot של חיץ A ב 37 °C (75 °F).
9. שטפו את הדגימות במשך 3 x 10 דקות במערבל התרמי בטמפרטורה של 37°C מתחת לתסיסה של 300 סל"ד.
10. במהלך השטיפה האחרונה, לדלל את הנוגדן המשני (1/200) ואת DAPI (1/10,000) בחיץ A ולדגור את הדגימות בתמיסה זו ב 37 ° C במשך 1 שעה לפחות.
11. שטפו את הדגימות במשך 3 x 20 דקות עם Buffer B (טבלת חומרים).
12. העבירו בזהירות את הדגימות בשקופית מיקרוסקופ, נגבו את שאריות החיץ B, הוסיפו 30 μL של אמצעי הרכבה, וכסו בכיסוי של 18 x 18 מ"מ. השתמשי בלק כדי לאטום את התכשיר.
13. אחסן את הדגימות עד שבוע אחד ב 4 ° C.
    הערה: עם זאת, מומלץ לבצע את ההדמיה בהקדם האפשרי כדי למנוע השפלה של אות הבדיקה.

3. הדמיה

1. קבל תמונות במצב רכישת xyz באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרות טבילת שמן 40x ו- 63x (טבלת חומרים). אות smFISH מזוהה על ידי גלאי HyD באמצעות מצב ספירת פוטונים.
2. אתר את הדגימות באמצעות אות DAPI ומנורת UV.
3. כדי לצלם את אבות השרירים הקשורים לדיסק הכנף ואת ה-IFMs (איור 2 ואיור 3), החל את ההגדרה הבאה עבור קווי לייזר ומסנני פליטה: בחר DAPI (עירור (לדוגמה) 405 ננומטר, פליטה (em.) 450 ננומטר), Alexa Fluor 488 (לדוגמה 496 ננומטר, em. 519 ננומטר), וקוואזר 670 עבור בדיקות smFISH (לדוגמה 647 ננומטר, em. 670 ננומטר).
4. כדי לצלם את ה-MuSCs למבוגרים (איור 2D), החל את ההגדרה הבאה עבור קווי לייזר ומסנני פליטה: בחר DAPI (לדוגמה 405 ננומטר, em. 450 ננומטר), Alexa Fluor 488 (לדוגמה 496 ננומטר, em. 519 ננומטר), Alexa Fluor 555 (לדוגמה 555 ננומטר, em. 565 ננומטר), וקוואזר 670 עבור בדיקות smFISH (לדוגמה 647 ננומטר, em. 670 ננומטר).
   הערה: לצורך ההדמיה, ניתן להתאים את אורכי הגל בהתאם לצבעים הקשורים לנוגדנים ובדיקות משניים.
5. שמור את התמונות הקונפוקליות כ- . קובצי TIFF.

4. ניתוח לאחר הדמיה

1. כדי להתחיל, הפעל את ImageJ ונווט לתפריט תוספים . משם, בחר פקודות מאקרו | ערוך כדי לפתוח את קוד המקור של פקודות המאקרו.
   הערה: פעולה זו תאפשר התאמה של הפרמטרים לפי הצורך, ובמידת הצורך, תשנה את ספריית התיקיות עבור כל ערוץ בתוך קוד המקור של המאקרו.
2. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה ולכמת כתמי Mef2 smFISH בזחלים, השתמש בהגדרות הבאות: Log_radius = 3.0 ו- Log_quality = 20.0. גרעיני סגמנט Mef2 חיוביים עם טשטוש = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8.0; nucleus_size = 300.
3. בסיבי שריר, השתמש בפרמטרים הבאים: Log_radius = 2.5; Log_quality = 60.0; טשטוש = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0.0; nucleus_size = 300.
4. כדי להפעיל את המאקרו, פשוט הפעל את פקודת ההפעלה והמתן עד שהמאקרו יטען באופן אוטומטי את כל התמונות מהתיקייה המיועדת ויכמת אותן באופן רציף.
   הערה: שים לב שמשך התהליך עשוי להשתנות בין מספר שניות למספר שעות, בהתאם לנפח הנתונים המנותחים.
5. חפש את התוצאות המוצגות בשני קבצי .csv חדשים: file_FISH_results ו- file_nuclei_results. הראשון מציג את מספר כתמי השעתוק ואת עוצמתם הממוצעת והמקסימלית. השני נותן גם את המספר הכולל של גרעינים וגם את מספר הכתמים בתוך כל גרעין.

Discussion

היישום של שיטת smFISH צבר פופולריות בתקופה האחרונה, כאשר השימוש בו משתרע על סוגי תאים שונים ואורגניזמים מודל. עם זאת, במקרה של דרוזופילה, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, שאינן מספקות מידע כמותי על המיקום המרחבי המדויק של מולקולות mRNA. כדי להתמודד עם פער זה, ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מקדימים של שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים. גישה זו הותאמה מפרוטוקול²³ שפורסם בעבר והותאמה לרקמות שריר דרוזופילה .

המכשול העיקרי בהשגת תמונות smFISH באיכות גבוהה הוא עובי השרירים הבוגרים, המעכב את החדירה האופטימלית של הבדיקות. לכן, חשוב להפריד את השרירים הבוגרים משאר רקמות החיה ולבצע את תהליך ההכלאה עם תסיסה קלה. שלב מסוים זה מבטיח חלחול יעיל של הרקמות.

היבט קריטי נוסף הוא שיחס אות לרעש יכול לגרום לצנרת החישובית להיכשל באיתור כתמי mRNA מסוימים. מצאנו כי הגדלת יחס האות לרעש יכולה להיות מושגת על ידי מציאת הריכוז האופטימלי של גשושיות. הדילול האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם להרכב של כל קבוצת בדיקה, כולל צבע מצומד והרכב אוליגונוקלאוטידים. אנו ממליצים לנסות דילולים שונים; דילול סופי של 200 ננומטר הניב את יחס האות לרעש הטוב ביותר עבור רקמות בוגרות בניסויים אלה.

בשיטת smFISH ניתן לכמת את מספר הרנ"א המסונתז החדש במוקדי TS. כאשר גן משועתק באופן פעיל, מספר רנ"א מתהווה מיוצרים בו זמנית ב-TS. כתוצאה מכך, עוצמת ה-TS תעלה על זו של רנ"א ציטופלזמי בוגר, ותכונה זו, בשילוב עם הלוקליזציה הגרעינית שלו, יכולה להבדיל בין ה-TS לבין רנ"א ציטופלזמי בודד. בהקשר של ביולוגיה של שרירים, זיהוי וכימות TS חשובים במיוחד לקביעת הסנכרון של שעתוק של גן מסוים בין גרעיני שריר בתוך אותו סינציטיום. עם זאת, צינור חישובי זה אינו מתוכנן להבדיל בין mRNA ציטופלזמי לבין אותות TS. כחלופה, אנו מציעים לשלב שיטת smFISH זו עם כלי ניתוח smFISH מבוססים אחרים, כגון BayFISH או FISH-quant^29,30. כלים אלה הוכחו כמאפשרים סגמנטציה אוטומטית וחישובי עוצמת פלואורסצנטיות של צברי RNA בדיוק יוצא דופן.

לבסוף, בעוד smFISH מזהה מולקולות mRNA עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הוא מוגבל לניתוח מספר קטן של mRNA בו זמנית. שיטות רב-ממדיות כמו merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) מאפשרות ניתוח סימולטני של מספר רב של mRNA³¹ שונים. על ידי שילוב של בדיקות אוליגונוקלאוטידים וקודים לתיקון שגיאות, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מאות מיני RNA בתאים בודדים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope SP8	Leica	SP8 DMI 6000
DAPI	ThermoFisher	62248
Double-sided tape	Tesa	57910-00000
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Formaldehyde 16%	Euromedex	EM-15710
Mef2 antibody	DHSB	NA
PBS 10x	Euromedex	ET330
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Stellaris probes	LGC	NA
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer	LGC	SMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A	LGC	SMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B	LGC	SMF-WB1-20
Swann-Morton Blades	Fisher scientific	0210
ThermoMixer	Eppendorf	5382000015
Triton X-100	Euromedex	2000
UAS-mCD8::GFP line	Bloomington	RRID:BDSC_5137
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	95284
Watch Glass, Square, 1 5/8 in	Carolina	742300
Zfh1 antibody	Gifted by Ruth Leahman
Zfh1-Gal4	Bloomington	BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625