O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.
A análise de célula única tornou-se a abordagem de escolha para desvendar a complexidade dos processos biológicos que requerem a avaliação da variabilidade das respostas celulares individuais ao tratamento ou infecção com resolução de célula única.
Muitas técnicas para perfil molecular de célula única foram desenvolvidas nos últimos 10 anos, e várias tecnologias dedicadas foram comercializadas. O perfil de célula única baseado em gotículas da 10X Genomics é uma tecnologia amplamente difundida que oferece reagentes prontos para uso para perfis de célula única transcriptômicos e multi-ômicos. A tecnologia inclui fluxos de trabalho para sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único (scRNA-Seq e snRNA-Seq, respectivamente), scATAC-Seq, perfil imunológico de célula única (sequenciamento BCR/TCR) e multioma. Este último combina informações transcricionais (scRNA-Seq) e epigenéticas (scATAC-Seq) provenientes da mesma célula.
A qualidade (viabilidade, integridade, pureza) de suspensões unicelulares ou de núcleo único isoladas de tecidos e analisadas por qualquer uma dessas abordagens é crítica para a geração de dados de alta qualidade. Portanto, os protocolos de preparo das amostras devem ser adaptados às particularidades de cada tecido biológico e garantir a geração de suspensões celulares e nucleares de alta qualidade.
Este artigo descreve dois protocolos para preparar amostras de cérebro e medula óssea para o pipeline 10X Genomics do multioma a jusante. Os protocolos são realizados passo a passo e abrangem dissociação tecidual, triagem celular, isolamento de núcleos e controle de qualidade da suspensão de núcleos preparada que é usada como material de partida para particionamento celular e código de barras, preparação de biblioteca e sequenciamento. Esses protocolos padronizados produzem bibliotecas de núcleos de alta qualidade e dados robustos e confiáveis.
Por muitos anos, as técnicas unicelulares têm sido o padrão-ouro para a análise de processos biológicos. Inicialmente, restringiram-se à fenotipagem unicelular por meio de microscopia, citometria de fluxo e ensaios similares. Um avanço na análise de célula única veio com o desenvolvimento de abordagens para perfil molecular de célula única, em particular o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq) que permitiu caracterizar todo o transcriptoma de células individuais. Altamente poderoso, scRNA-Seq gera informações sobre o status transcricional de uma célula em uma condição e ponto de tempo específicos. No entanto, não fornece visibilidade sobre a regulação gênica que impulsiona a transcrição, ou sobre as modificações moleculares que ocorrem ao longo do tempo. Para superar essa limitação, muitos esforços têm sido investidos no desenvolvimento de ensaios multiômicos unicelulares que possibilitem a análise de múltiplos fatores e processos de uma mesma célula1,2,3,4. A primeira medida bem-sucedida de duas modalidades dentro de células individuais veio através da ligação de padrões de expressão de proteínas de superfície multiplex com o transcriptoma completo de células individuais na abordagem CITE-Seq5. Evoluções mais recentes combinam a expressão gênica com a acessibilidade da cromatina (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), capturando simultaneamente modalidades transcriptômicas e epigenômicas nas mesmas células (por exemplo, sci-CAR)6. As primeiras soluções comerciais que permitiram associar a transcriptômica ao fenótipo celular ou a alterações epigenéticas de uma mesma célula vieram da 10X Genomics.
Os experimentos para perfil molecular de célula única contêm as seguintes etapas: (1) dissociação tecidual ou preparação de suspensões de célula única; (2) purificação e/ou isolamento de núcleos celulares; (3) particionamento e código de barras; (4) construção de bibliotecas e controle de qualidade; (5) sequenciamento de próxima geração; (6) análise dos dados. Enquanto os passos (3)-(6) podem variar significativamente dependendo da tecnologia empregada, os passos iniciais são geralmente comuns a todos eles. A qualidade da suspensão de células/núcleos preparada determinará o resultado global do experimento. Dependendo do tipo de tecido, a obtenção de suspensões unicelulares/núcleos de alta qualidade pode ser um desafio. As particularidades de alguns tecidos, como coração, músculo, cérebro, pulmão, intestino, entre outros, requerem métodos de ruptura tecidual e isolamento de núcleos adaptados a cada tipo de amostra, a fim de garantir a produção de núcleos de alta qualidade para análise molecular7,8,9,10. Os métodos de ruptura tecidual e os protocolos de dissociação podem ser mecânicos, enzimáticos (por exemplo, uma mistura de colagenases e DNase) ou uma combinação dos dois, e podem ser realizados manualmente ou por instrumentos (por exemplo, Qiagen DSC-400, gentleMACS).
As técnicas unicelulares tornaram-se uma ferramenta de escolha para a pesquisa biomédica. Em neurobiologia, a diversidade celular no cérebro e a complexidade de suas funções requerem análises de alta resolução e alto rendimento para visualização de populações celulares raras e para avaliação de sua heterogeneidade 11,12,13,14. Ligar a identidade celular e os mecanismos de regulação gênica de células individuais fornece insights sobre o desenvolvimento e a fisiologia do cérebro. Outro exemplo são os estudos de resposta imune no contexto de doenças infecciosas, autoimunes ou oncológicas, que dependem fortemente de análises unicelulares. A heterogeneidade dos subgrupos de células imunes e a complexidade de sua atividade e interações com outros tipos celulares requerem resolução de célula única para decifrar os mecanismos subjacentes à resposta imune. As células imunes se originam da medula óssea, onde os progenitores hematopoiéticos são compostos por células que gradualmente se diferenciam e adquirem e perdem marcadores de superfície celular ao longo de um processo gradual antes de sair da medula óssea para a periferia. A análise unicelular permite a caracterização minuciosa dos estágios de desenvolvimento celular. Pode ser realizada através da fenotipagem unicelular, convencionalmente realizada por citometria de fluxo multiparâmetro. No entanto, foi demonstrado que assinaturas transcriptômicas de célula única revelam uma identificação mais precisa dos subtipos de células progenitoras, uma vez que essas células estão distribuídas em agrupamentos que caem umas nas outras e, portanto, podem ser erroneamente identificadas quando se usa uma abordagem de marcador de superfície celular grossa15. Um número crescente de estudos revela as modificações epigenéticas que as células-tronco hematopoéticas e as células progenitoras (HSPCs) podem adquirir a partir da exposição a vários agentes, levando a um impacto significativo na responsividade do sistema imune em longo prazo 16,17,18,19. As novas tecnologias multi-ômicas permitem estudar esses processos com resolução de célula única.
Vários protocolos de isolamento celular e nuclear têm sido descritos para amostras de cérebro11,20,21,22 e medulaóssea23,24. Para minimizar o viés devido à variabilidade experimental, é necessário validar protocolos otimizados de preparação de núcleos únicos para sequenciamento epigenômico e transcriptômico de célula única, garantindo assim a reprodutibilidade de ensaios multiômicos de célula única.
Aqui, dois protocolos robustos para a preparação de núcleos a partir de (1) tecido cerebral fresco congelado e (2) HSPCs de medula óssea fresca para análise de multioma de célula única a jusante são descritos (Figura 1).
Figura 1: Representação esquemática dos protocolos de isolamento de núcleos de tecidos cerebrais e medulares frescos congelados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os procedimentos experimentais foram conduzidos sob a estrita conformidade regulatória de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA). Para o isolamento dos núcleos cerebrais, foram utilizados camundongos C57BL/6 com 3 meses de idade. Para o isolamento da medula óssea, foram utilizados camundongos fêmeas C57BL/6J, com 8 semanas de idade, pesando 18 g.
1. Purificação de núcleos do cérebro de camundongos
OBS: Usar luvas de látex ou nitrílica em todos os momentos durante o procedimento. É altamente recomendável ter duas pessoas realizando o experimento, para que as etapas 1 a 3 (ou seja, preparação da suspensão de núcleo único) sejam realizadas por uma pessoa, e a etapa 4 (ou seja, preparação do classificador) seja executada em paralelo por outra pessoa. Como o protocolo é altamente sensível ao tempo, é fundamental minimizar o tempo de processamento da amostra tendo o classificador pronto assim que a suspensão de núcleo único é preparada.
2. Purificação de núcleos de células-tronco hematopoéticas e progenitoras de medula óssea de camundongos (HSPCs)
NOTA Este protocolo descreve a purificação de núcleos de três subgrupos de HSPCs da medula óssea: linhagem-c-Kit+Sca-1+ células-tronco hematopoéticas (HSC), linhagem-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- progenitores mieloides comuns (CMP) e linhagem- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ progenitores de granulócitos e monócitos (GMP). Use luvas de látex ou nitrilo em todos os momentos durante o procedimento. Este protocolo é uma adaptação do 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27. Modificações foram introduzidas no protocolo original para maximizar a recuperação dos núcleos. É altamente recomendável ter duas pessoas realizando o experimento, para ter os passos 1. até 3. (i.e., preparação da solução unicelular) realizada por uma pessoa, e a etapa 4 (i.e., preparação do classificador) realizada em paralelo por outra pessoa. Como o protocolo é altamente sensível ao tempo, é fundamental minimizar o tempo de processamento da amostra tendo o classificador pronto assim que a suspensão de célula única é preparada.
Os dois protocolos descritos acima detalham o isolamento de núcleos a partir de dois tipos diferentes de tecido. As diferenças e semelhanças entre os dois protocolos estão esquematicamente representadas na Figura 1.
Purificação de núcleos de cérebro de camundongos
No protocolo aqui descrito, propomos um método suave para a preparação de núcleos a partir de amostras cerebrais. Inicia-se com uma dissociação mecânica do tecido cerebral em um tampão de lise, seguida por etapas de lavagem e filtragem do filtro que removem o tecido restante da suspensão. A remoção subsequente de detritos, células não lisadas e pequenas partículas é conseguida pelo FACS para garantir que apenas núcleos purificados sejam carregados para o protocolo Multiome a jusante. A Figura 2 mostra o perfil dos núcleos antes e após a triagem. Após a filtragem e antes da triagem dos núcleos, a amostra contém uma alta quantidade de debris, com mais de 99% dos "singletes" positivos para coloração nuclear (7-AAD), indicando lise celular ótima (Figura 2A). Os núcleos são classificados com base no portão positivo de 7-AAD. Uma fração de material triado é adquirida para verificar a pureza dos núcleos preparados. A Figura 2B mostra o perfil dos núcleos cerebrais após a triagem. A triagem dos núcleos permitiu um aumento na pureza dos núcleos dos 36% iniciais (Figura 2A) para quase 100% (Figura 2B).
Figura 2: Estratégia de agrupamento para classificação de núcleos e teste de pureza após a triagem. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. (A) Os núcleos são primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente). Partículas individuais são então selecionadas com base em suas propriedades FSC-A/FSC-H e coloração 7-AAD. (B) Após a triagem celular, uma fração dos núcleos do tubo de coleta é testada quanto à pureza usando a mesma estratégia de fechamento que em A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Purificação de progenitores de células-tronco hematopoéticas (HSPCs) de medula óssea de camundongos
Após o isolamento da medula óssea, até 2 x 105 HSPCs são classificados por FACS, de acordo com a estratégia de gating mostrada na Figura 3A. A eficácia da triagem e a pureza da amostra são avaliadas (Figura 3B).
Figura 3: Estratégia de gating para triagem de HSPCs de medula óssea. (A) Uma estratégia representativa de agrupamento FACS para a triagem de células-tronco hematopoéticas LKS+ viáveis e progenitores mieloides CD34+ para isolamento de núcleos. (B) Parcelas FACS representativas utilizadas para a verificação da pureza da população celular classificada. São mostradas as proporções de diferentes subconjuntos celulares em relação à população parental. *As duas populações classificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo "Low Cell Input Nuclei Isolation" permite o isolamento de núcleos de amostras com um máximo de 10 a5 células. Inclui um baixo número de etapas de centrifugação, minimizando assim a perda de células/núcleos. Ajustamos o volume de tampões de lise e lavagem proporcionalmente à entrada celular e aumentamos o tempo de centrifugação para máxima recuperação dos núcleos. Realizamos um experimento piloto para avaliar a quantidade de núcleos recuperados por contagem e sua qualidade por citometria de fluxo e microscopia. A Figura 4 mostra a amostra de HSPCs após lise celular. Esse protocolo gerou núcleos de alta qualidade, como observado na Figura 5A, sem detritos que pudessem impactar o protocolo de multioma a jusante.
Figura 4: Classificação do teste de pureza dos núcleos isolados de HSPC da medula óssea. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. Os núcleos foram primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente) para avaliar a pureza da amostra. A proporção de núcleos é indicada em relação à população parental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Número do tubo | Nome do tubo | Entidade manchada | Quantidade de entidade manchada | Anticorpo/corante (μL) | Buffer de coleta (μL) |
1 | Sem manchas | Células | 5,00,000 | N/A | 200 |
2 | LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell | Células | 5,00,000 | 0.5 | |
3 | APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
4 | Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
5 | PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
6 | APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
7 | FITC anti-mouse CD34 | OneComp eBeads | 15 μL | 1 |
Tabela 1: Controles de coloração única para ajustes de compensação no citômetro de fluxo. São indicados os controles de coloração única necessários, o número de células ou contas a serem coradas e as quantidades de anticorpos.
Master Mix | Reagente | Diluição final | Anticorpo/corante (μL) | Tipo de buffer | Tampão (μL) |
Mistura 1 | APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR) | 1/500 | 1.2 | DPBS | 300 |
LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell | 1/250 | 2.4 | |||
Mistura 2 | Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico | 1/20 | 30 | Buffer FACS | 300 |
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | 1/200 | 3 | |||
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | 1/200 | 3 | |||
FITC anti-mouse CD34 | 1/50 | 12 | |||
Volume total de coloração | 600 |
Tabela 2: Composição da mistura de coloração para HSPCs de medula óssea. São mostrados os volumes de reagentes necessários para a coloração de uma amostra contendo 40 milhões de células. Para colorir um número maior de amostras, multiplique o volume indicado pelo número necessário de amostras e adicione metade de um volume de amostra extra para garantir um volume suficiente da mistura principal.
Figura suplementar 1: Protocolo de isolamento de células da medula óssea. (A) Abra o peritônio. Linhas pontilhadas brancas indicam a linha a ser cortada. (B) Depois de descascar a pele da pata traseira, forre a tesoura ao longo da coluna vertebral na articulação do quadril para cortar a perna sem cortar o fêmur. (C) A aparência da perna separada do corpo antes da remoção do músculo. (D) O aparecimento da perna após a remoção do músculo. (E) O procedimento para separar o fêmur na articulação do joelho, depois na articulação do quadril, tomando cuidado para não abrir o fêmur. As setas curvas brancas mostram o movimento necessário. (F) Procedimento para abrir a parte distal do fêmur (ou seja, a parte previamente presa à tíbia na articulação do joelho) segurando firmemente a cartilagem e a epífise distal com tesoura e virando-a para trás para expor a medula óssea. (G) Quatro saliências, indicadas por setas pretas, devem ser visíveis na extremidade exposta da fise. (H) A aparência de um fêmur com a extremidade aberta voltada para baixo no tubo preparado de 0,5 mL colocado dentro de um tubo de 1,5 mL contendo 150 μL de tampão FACS. (I) O aparecimento das células da medula óssea peletizadas e do fêmur agora branco após rápida centrifugação a 12.000 x g. Clique aqui para baixar este arquivo.
A preparação de suspensão de células ou núcleos de alta qualidade é de importância crucial para o sucesso de análises multiômicas de RNA-Seq de célula única ou de núcleo único 29,30,31. Aqui, descrevemos protocolos de preparo de amostras e isolamento de núcleos para ensaios de multioma de dois tipos de tecido: cérebro e medula óssea.
O protocolo cerebral descrito neste trabalho permite a recuperação de núcleos de alta qualidade a partir de tecido cerebral fresco-congelado. Inclui as seguintes etapas: ruptura do tecido congelado, isolamento dos núcleos, purificação dos núcleos e controle de qualidade do material preparado. O tecido cerebral é composto por diversos tipos celulares, e o procedimento de dissociação tecidual e isolamento de núcleos deve preservar as proporções das populações celulares presentes no tecido inicial. Aqui, a composição do tampão de lise e o tempo de incubação foram otimizados para permitir a lise completa e suave de todas as populações celulares que compõem o tecido.
O protocolo de HSPCs de medula óssea é um pouco diferente, pois requer uma etapa adicional no início do experimento para isolar a população celular de interesse de uma suspensão celular heterogênea. Após a coleta do tecido fresco, as hemácias são lisadas e a amostra é enriquecida para o subconjunto celular de interesse. As células-alvo são lisadas, os núcleos são isolados e a qualidade do material preparado é controlada.
A 10X Genomics fornece vários protocolos validados para isolamento de núcleos em diversos tecidos 32,33. A empresa também comercializa um kit de isolamento de núcleos com uma tubulação simples para isolar núcleos de tecidos validados34. No entanto, esses protocolos necessitam de otimização adicional para adequar as particularidades de determinadas amostras. Um exemplo são as amostras que exigem trabalhar com baixa entrada de células. Para essas amostras, as etapas mais desafiadoras são as centrifugações que precisam ser suficientemente rigorosas para limpar a amostra e suaves o suficiente para evitar a perda de células/núcleos. Com o protocolo aqui descrito, adaptamos o 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 para encontrar um equilíbrio fino entre esses dois requisitos. Como demonstrado no exemplo da preparação de núcleos a partir de HSPCs triados, melhoramos a recuperação de núcleos sem impacto na qualidade da amostra.
Um desafio adicional é a etapa de lise das células purificadas para isolamento dos núcleos. Condições de lise mais severas e tempos de incubação mais longos podem danificar os núcleos e, assim, afetar a qualidade dos dados de sequenciamento. A Figura 5 mostra imagens representativas de núcleos de amostras de medula óssea em diferentes tempos de incubação com tampão de lise e ilustra como o estado dos núcleos pode ser diferente dependendo da lise celular. No exemplo dos HSPCs, identificamos a lise de 3 min como a condição que resulta na maior proporção de núcleos intactos com aparência saudável e a menor proporção de núcleos danificados. Os tempos de incubação da lise devem ser otimizados para cada novo tipo de amostra.
Figura 5: Controle de qualidade dos núcleos por microscopia. São mostradas imagens representativas de campo brilhante de núcleos isolados da medula óssea de camundongos com (A) núcleos intactos e (B) danificados. Barra de escala 5 μm. As imagens foram obtidas com microscópio invertido, utilizando-se objetiva ELWD NA, 0,60 e zoom digital de 1,5x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ambos os protocolos detalhados neste trabalho baseiam-se na purificação de células-alvo ou núcleos por instrumentos FACS de alto rendimento. Esta etapa é de importância crucial para protocolos de preparação de células únicas/núcleos onde subconjuntos raros de células devem ser isolados de suspensões heterogêneas. Nestes, como no exemplo mostrado aqui para a classificação de HSPCs, um painel de citometria de fluxo de alta dimensão pode ser necessário para permitir o "gating" na população celular de interesse. A classificação é extremamente rápida e precisa, levando a mais de 95% de pureza dos subconjuntos de células classificadas. Essa abordagem expõe a suspensão celular a uma pressão de até 70 psi e, portanto, pode ser limitante para a triagem de células frágeis (por exemplo, células dendríticas, neutrófilos), uma vez que pode causar a ruptura de sua membrana celular. Nesses casos, soluções alternativas devem ser selecionadas para purificação celular, incluindo classificação magnética, aplicação de instrumentos de nova geração (por exemplo, CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, ou sistemas baseados em gotículas (por exemplo, ODIN, Sensific)37. No entanto, a lenta velocidade de classificação dessas tecnologias, com a triagem celular que dura horas em vez de minutos, é um forte fator limitante para a aplicação dessas abordagens na preparação de células viáveis para o Multiome e outras aplicações unicelulares baseadas na análise de grandes números de células.
Para a purificação de núcleos isolados do tecido, o FACS é o método de escolha devido ao seu rendimento e à pureza do material isolado. Os núcleos não são sensíveis à pressão, e os isolados de tecido filtrado podem ser facilmente purificados através do classificador celular. Se o laboratório não estiver equipado com um instrumento FACS, existem outras alternativas, um pouco menos eficientes, mas suficientemente boas. Exemplos incluem ultracentrifugação ou o uso de pequenos equipamentos como o MARS (Applied Cell) que separa partículas com base em sua diferença de tamanho, usando ondas acústicas; Lavadora laminar CURIOX que utiliza propriedades hidrofóbicas de suspensões de células/núcleos; ou LEVITAS bio que se baseia em propriedades físicas das células (levitação) para separá-las dos detritos.
Aqui, descrevemos protocolos para obtenção de um alto número de núcleos e a melhor pureza para o protocolo Multiome a jusante. A classificação FACS e as etapas repetidas de centrifugação resultam em uma perda substancial do material inicial. Por esta razão, no protocolo de preparação de núcleos do cérebro que descrevemos aqui requer material de partida suficientemente abundante para resultar na coleta de pelo menos 500.000 núcleos após a triagem FACS. Protocolos alternativos devem ser aplicados se esse critério não puder ser correspondido. Ao trabalhar com populações celulares raras ou pequenos cortes de tecido, a quantidade disponível de material inicial pode ser um fator limitante. Para resolver essa questão, é possível melhorar a recuperação de núcleos (a) reduzindo o volume de lise, (b) reduzindo o volume de lavagem, (c) usando uma única lavagem com tempo de centrifugação prolongado para tentar melhorar a recuperação, conforme indicado nos protocolos de Genômica 10X para isolamento de núcleos de baixa entrada celular. Para análise multiômica de material de baixo conteúdo, vale a pena considerar aplicações baseadas em placas, como scNMT, SNARE-seq e Paired-seq38 , que exigem muito menos amostras de entrada.
Em resumo, descrevemos dois protocolos robustos para a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea HSPCs para análise do Multiome a jusante. Esses protocolos são aplicáveis em qualquer projeto científico que exija suspensões de núcleo único de alta qualidade desses dois tipos de tecido, independentemente da questão científica colocada. Nosso grupo vem aplicando o protocolo de isolamento de núcleos cerebrais em estudos do desenvolvimento cerebral após a inativação de vários genes-alvo e em estudos de resposta imune no contexto de doenças neurológicas. Estamos utilizando o protocolo de isolamento de núcleos da medula óssea para decifrar a participação de várias subpopulações hematopoéticas no estabelecimento do sistema imune.
Ana Jeemin Choi foi apoiada por uma bolsa do Programa de Doutorado Internacional Pasteur - Universidade de Paris (PPU).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) | BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
Transparent nail polish | any | non-applicable | |
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |
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