פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN). שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

Abstract

ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק יכולים להיווצר קומפלקסים על ידי מולקולות הטרוביפונקציונאליות בתהליך רב-שלבי. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות המעורבות תורמות ליעילות היוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון. טכניקות ביופיזיקליות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) מספקות מידע רב ערך שניתן להשתמש בו באופטימיזציה של אינטראקציות אלה. באמצעות שתי מערכות מודל, הוקמה ערכת כלים לבדיקה ביופיזית להבנת הקואופרטיביות של היווצרות מרוכבים טרינריים והשפעת "אפקט הוו" על קינטיקה קשירה. במקרה אחד, נבדקה מולקולת פרוטאוליזה המכוונת לכימרה (PROTAC) שגרמה להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4^BD2 ו-VHL. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, MZ1, יש זיקות nM הן לחלבון Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) והן לקומפלקס VHL (SPR K_D = 29 nM, itc k _d = 66 nM). עבור מערכת זו, פותחו מבחני SPR, BLI ו- ITC חזקים ששיחזרו תוצאות שפורסמו המדגימות את הקואופרטיביות של היווצרות מורכבת טרינרית. במקרה השני, נחקרה מולקולה שגרמה לקומפלקסים טרינריים בין חלבון 46.0 kDa PPM1D וצרבלון [CRBN (319-442)]. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, BRD-5110, יש SPR K D = 1 ננומטר עבור PPM1D אך קשירה חלשה בהרבה כנגד קומפלקס CRBN קטוע (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). במקרה זה, הכריכה עבור CRBN ב- SPR לא הייתה רוויה, וכתוצאה מכך נוצר "אפקט וו". הוערכו דרישות התפוקה והמגיבים עבור SPR, BLI ו-ITC, וניתנו המלצות כלליות ליישומן בפרויקטים של PROTAC.

Introduction

polyubiquitination של חלבונים בתא הוא תהליך מווסת היטב המערב אנזימים ממשפחת Ubiquitin Ligase ^1,2. האנזימים הסופיים במסלול הם ליגאזות יוביקוויטין E3 המצמידות באופן קוולנטי מולקולות יוביקוויטין לשותפיהן קושרי החלבונים³. הפוליוביקוויטינציה של אותם שותפים קושרי חלבונים מכוונת אותם לפירוק פרוטאוליטי על ידי פרוטאזום⁴. מערכת זו היא חלק מתהליך הומאוסטזיס חלבונים אשר מונף טיפולית כדי לגרום לפירוק של חלבונים המעורבים במחלה⁵. מולקולות קטנות הגורמות לאינטראקציה בין ליגאזות יוביקוויטין E3, כגון Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) או cereblon (CRBN), מורכ....

Protocol

כל החלבונים בוטאו יתר על המידה ב- E.coli עם תפוקה טובה וטוהר (>80%) בהתאם לפרוטוקולי הספרות¹⁸. ביוטינילציה בוצעה באמצעות תגובה זרזי BirA¹⁸. כל המולקולות הקטנות הוכנו בתמיסות מלאי של 1 מילימטר ב-100% DMSO. הנהלים המתוארים כאן אינם דורשים ציוד בטיחות מיוחד במעבדה או אמצעי זה?.......

Discussion

אפיון ביופיזי של יחסי הגומלין הבינאריים והטרינריים בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים יכול לספק תובנות ייחודיות ומשלימות ביחס למערכות תאיות בשימוש נרחב. הבנת הזיקה בין כל ראש קרב של מולקולת PROTAC לבין שותפיה קושרי החלבונים יכולה לעזור להנחות את מאמצי הכימיה הרפואית לקראת או.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments